Herbicidas a base de Glifosato produce efectos teratogénicos en vertebrados interfiriendo en el metabolismo del Ácido Retinoico. Alejandra Paganelli, Victoria Gnazzo, Helena Acosta, Silvia L. Lopez, and Andres E. Carrasco* Laboratorio de Embriología Molecular, CONICET-UBA, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, Paraguay 2155, 3° piso (1121), Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina

El glifosato herbicida de amplio espectro es ampliamente usado en la Agricultura mundial. Ha habido prolongadas controversias en relación a los posibles efectos adversos del glifosato sobre el medio ambiente y la salud humana. Informes sobre defectos neuronales y malas formaciones craneoencefálicas desde regiones donde son usados herbicidas a base de glifosato (GBH) nos lleva a desarrollar una exploración embriológica para explorar los efectos de bajas dosis de Glifosato en el desarrollo. Embriones de Xenopus Laevis fueron incubados con diluciones de 1/5000 de un herbicida en base de glifosato en su forma comercial. Los embriones tratados fueron altamente anormales con marcadas alteraciones en el desarrollo de la cresta neural y cefálica y acortamiento del eje antero-posterior (A- P). Alteraciones en los marcadores de la cresta neural fueron después correlacionadas con deformidades en los cartílagos craneales en el estadio de renacuajo. Embriones inyectados con glifosato puro mostraron fenotipos muy similares. Además GBH produce efectos similares en embriones de pollo mostrando una pérdida gradual de rombomeras, reducción de las vesículas ópticas y microcefalia. Esto sugiere que el glifosato por sí mismo es el responsable de los fenotipos observados, más que el surfactante u otro componente de la fórmula comercial. La prueba de los genes reporter revela que el tratamiento con GBH aumenta la actividad del Ácido Retinoico endógeno en los embriones de Xenopus y que el contratamiento con un antagonista del Ácido Retinoico impide los efectos teratogénicos del glifosato. Por lo tanto podemos concluir que los fenotipos producidos por GBH son principalmente una consecuencia del aumento de la actividad del Retinoico endógeno. Esto es consistente con la disminución de la marcación de Sonic hedgehog (SHH) desde la línea media dorsal del embrión con la inhibición de otx2 y con disrupción del desarrollo de la cresta neuronal cefálica. Los efectos directos del Glifosato sobre los mecanismos tempranos de la morfogénesis en los embriones de vertebrados abren a la discusión sobre los hallazgos clínicos de la descendencia humana en poblaciones expuestas al GBH en campos agrícolas.

Introducción Los herbicidas de amplio espectro en base de glifosato son ampliamente usados en las prácticas agrícolas, particularmente asociados con los organismos modificados genéticamente diseñados para ser resistentes al glifosato, tales como los cultivos de soja. Considerando el amplio uso del GBH/OMG en la agricultura, estudios de los posibles impactos del glifosato en el medio ambiente y la salud humana son importantes y actuales. Dado el uso intensivo de este paquete tecnológico en América del Sur, estudios sobre los posibles impactos en el medio ambiente y la salud humana son absolutamente necesarios junto con adecuados estudios epidemiológicos. La necesidad de información acerca del impacto que tiene el glifosato sobre el desarrollo es reforzado por una variedad de efectos adversos sobre la salud en personas que viven en áreas donde el glifosato es usado extensivamente, particularmente ya que hay pobreza de datos en relación a la exposición crónica de dosis subletales durante el desarrollo del embrión. Es importante tener en cuenta que la mayor parte de los datos facilitados durante las etapas de evaluación de GBH / seguridad OMG fueron proporcionados por la industria. Dada la historia reciente de desorganización en el campo endocrino con efectos observados con bajas dosis en numerosos laboratorios académicos, pero no en los estudios financiados por la industria (1, 2), es evidente que un cuerpo razonable de estudios independientes es necesario evaluar plenamente los efectos de los agroquímicos sobre la salud humana. Esto es particularmente importante cuando están implicados significativos intereses económicos. Existe una creciente evidencia concerniente al aumento de los efectos del GBH en personas que viven en áreas donde los herbicidas son utilizados intensivamente. Las mujeres expuestas durante el embarazo a los herbicidas tienen descendencia con malformaciones congénitas, incluyendo microcefalia, anencefalia y malformaciones craneales (3).

Contribuciones relevantes al tema fueron realizadas por grupo Seralini, entre otros (4). Ellos demostraron que el GBH actúa como un disruptor endocrino en cultivos de células de la placenta JEG3, disminuyendo los niveles de ARNm de la enzima CYP19 (un elemento esencial componente del citocromo p450 aromatasa) e inhibiendo su actividad. CYP19 es responsable de la conversión irreversible de los andrógenos a estrógenos. GBH Roundup es capaz de interrumpir la actividad de la aromatasa. Destacadamente el principio activo del glifosato interactúa con el sitio activo de la enzima purificada y sus efectos en cultivos celulares, y los microsomas son facilitados por otros componentes de la fórmula del Roundup que, presumiblemente, aumentar la biodisponibilidad de glifosato (4). El glifosato penetra a través de la membrana celular y la posterior acción intracelular es facilitada en gran medida por adyuvantes tales como tensioactivos (5, 6). Además, ambos el glifosato y los herbicidas comerciales afectan gravemente a las células embrionarias y de la placenta, produciendo daño mitocondrial, necrosis y muerte celular programada por la activación de las caspasas 3 / 7 en cultivo celular dentro de las 24 hs con dosis muy por debajo de los utilizados en la agricultura. Otros efectos observados incluyen citotoxicidad y genotoxicidad, alteraciones endocrinas, de los receptores andrógenicos y estrógenicos, y daño del ADN en líneas célulares (7, 8). Más recientemente, ratas alimentadas con maíz modificado genéticamente (resistentes al glifosato) muestran alteraciones funcionales en dos órganos detoxificantes: riñones e hígado y en el corazón y el sistema hematopoyético (9). Otra línea de evidencia que apoya los efectos adversos del glifosato fue proporcionada por el grupo de Belle. Sugirieron que el glifosato y su principal metabolito, AMPA, altera los puntos de control del ciclo celular interfiriendo con el mecanismo fisiológico de reparación de ADN. Varios GBHs han sido ensayados, y ellos indujeron defunciones en el ciclo celular, en la primera división celular en los embriones de erizo de mar (10, 11). El umbral de concentración para este efecto es 500 - 4000 veces más baja que el que se rocía en los cultivos en el campo. Glifosato ocho milimolar

induce un retraso en la cinética del primer clivaje celular de erizos de mar, alterando la entrada en la fase S al interferir con la activación de la CDK1/cyclin Complejo B (6, 12). Este fracaso de los puntos de control del ciclo celular es sabido que lleva a la inestabilidad genómica y el posible desarrollo de cáncer. De acuerdo con estos resultados, los estudios de genotoxicidad de glifosato o sus metabolitos sugieren que los daños irreversibles en el ADN pueden aumentar el riesgo de carcinogénesis (13, 14). Aparte de lo que se informó anteriormente sobre efectos teratogénicos de las formulaciones a base de glifosato en las estructuras cefálicas en anfibios (15), casi no hay información disponible sobre los mecanismos moleculares asociados a GBH a la teratogénesis del glifosato. Informes de los defectos neurales y las malformaciones craneofaciales desde las regiones donde GBHs se utilizan en gran medida nos ha llevado a una aproximación embriológica para explorar los efectos de dosis bajas de glifosato en Xenopus y embriogénesis del pollo. Hemos demostrado que la dosis subletales son suficientes para inducir malformaciones reproducibles en Xenopus y embriones de pollo tratados con una dilución 1 / 5000 de una formulación GBH (equivalente a 430 uM de glifosato) o en embriones de rana inyectados con glifosato solo (entre 8 y 12 uM por célula inyectada). Embriones de rana tratados con GBH o inyectados con glifosato mostraron fenotipos muy similares, incluyendo el acortamiento del tronco, la reducción cefálica, microestalmia, ciclopía, la reducción del territorio de la cresta neural en el estadio de Neurula y malformaciones craneofaciales en etapas de renacuajo. Estos defectos siguieren un vínculo con la vía de señalización del ácido retinoico (AR). Ensayos de gen reporter con un dependiente de AR reveló que el tratamiento con GBH aumenta la actividad del AR endógeno. Sorprendentemente, se demuestra que Ro 41-5253 (Ro), un antagonista de la AR (16, 17), revierte los fenotipos producidos por GBH. Proponemos que al menos algunos de los efectos teratogénicos de GBH están mediados por un aumento de la actividad del AR endógeno en los embriones. Esto es consistente con el síndrome muy conocido producido por un exceso de AR, según lo descrito por el estudio epidemiológico de Lammer et al. En los seres humanos (18) y en embriones de vertebrados (1925).

Procedimientos experimentales Cultivos embrionarios y tratamientos. Los embriones de Xenopus laevis fueron obtenidos por fertilización in vitro, se incubaron en 0,1 × la solución salina modificad de Barth (MBS) (26) y por estadios de acuerdo a Nieuwkoop y Faber (27). El GBH utilizado fue Roundup Classic (Monsanto), que contiene 48% peso / volumen de una sal de glifosato. Los tratamientos fueron realizados desde el estadio de dos células con diluciones de GBH 1 / 3000, 1 / 4000, y 1 /5000 preparado en 0,1 × MBS. Para los experimentos de rescate, 0,5 o 1 uM Ro-415.253 fue agregado en el estadio 9. Ciclopamina (Sigma C4116) fue usada a una concentración de 100 uM en 0,1 × MBS y se aplicó a partir del estadio de 2 células hasta la fijación. Los embriones fueron fijados en MEMFA (28) cuando los controles mellizos alcanzaron el estadio deseado. Los embriones de Xenopus fueron inyectados, todo en base de Hibridación In Situ y el cartílago de tinción. Los embriones fueron inyectados con 360 o 500 pg de glifosato (N-fosfonometil) glicina (SIGM 337.757) por célula, dentro de una célula o de ambas células en el estadio de dos células. El glifosato fue coinyectado con 10 ng de dextrano Oregon Green (DOG, Sondas moleculares) para identificar el sitio inyectado como se describió previamente (29). Los embriones se cultivaron en 0,1 × MBS y fijados en MEMFA cuando los controles mellizos alcanzaron el estadio deseado. Wholemount hibridación in situ (WMISH) marcado con digoxigenina sondas de ARN antisentido se realizó como se describió previamente (30) excepto que el paso de proteinasa K fue omitido. Para la visualización del cartílago, los embriones fueron fijados en MEMFA en los estadios 45 a 47, lavados con PBS, y se tiñen durante la noche en un 0,04% Azul de Alcian, el 20% ácido acético, y el 80% de etanol. Después de un lavado con etanol y blanqueo con un 2% de KOH, los embriones se lavaron con 20% glicerol y el 2% de KOH, y deshidratado a través de un glicerol / 2% de KOH serie hasta el 80% de glicerol se alcanzó.

Detección de Actividad de la AR. Los embriones fueron inyectados en una célula en el estadio de dos células con 320 pg de plásmido RAREhplacZ (RAREZ) (31, 32) y se coloca inmediatamente en diluciones 1 / 3000, 1 / 4000, y 1 / 5000 de GBH. La iluminiscencia basal fue detectada en embriones no inyectados y no tratados. La actividad de la AR endógeno fue medida en embriones inyectados con RAREZ y dejados sin tratar. Como controles positivos, fueron inyectados embriones con el plásmido RAREZ e incubados en la fase de blástula tardía con 0.5 o 5 uM- ácido transretinoico (AR, Sigma R2625). Para los experimentos de rescate, embriones inyectados con el plásmido reportero fueron incubados en un dilución 1 / 4000 del GBH del estadio de 2 células, y cuando llegaron al estadio de blástula, se añadió 1 uM de Ro 41-5253. Por último cuando los controles mellizo alcanzaron el estadio de Néurula (14, 15), todos los embriones se procesaron para la cuantificación de quimioluminiscencia de la actividad del reportero mediante el ensayo de un gen reportero Beta-gal (Roche).Los extractos de Proteína y las reacciones enzimáticas se realizaron como se ha reportados (33). La iluminiscencia fue medida en muestras duplicadas en tres equipos FlexStation (Molecular Devices), y los valores se normalizaron por contenido proteico (32). Una prueba T de dos colas fue empleada para analizar la importancia de la diferencia de los medios. El experimento se repitió tres veces. Los tratamientos de embriones de pollo. Después de la apertura de una pequeña ventana en la cáscara, los huevos de pollo fertilizados (cepa blanca Leghorn) fueron inyectados por encima de la cámara de aire en la membrana interna con 20 uL de 1 / 3500 o 1 / 4500 diluciones de GBH. Embriones de control fueron inyectados sólo con 20 uL de H2O. Después de la inyección, la ventana fue sellada con cinta adhesiva transparente, y los huevos se colocaron a temperatura ambiente durante 30 min. Luego, los huevos se incubaron en oscuridad a 38 ° C en un incubador humidificado (5658% de humedad) y rotados a intervalos regulares. Después de un adecuado tiempos de incubación, los embriones fueron aislados y asignados a los estadios de acuerdo a Hamburger y Hamilton (34). Todo el montaje Inmunofluorescencia y WMISH de Embriones pollo. Los embriones fueron fijados de 2 a 4 hs en una preparación fresca de 4% paraformaldehído, enjuagados, y procesado para su análisis. Para inmunofluorescencia, los embriones fueron bloqueados durante la noche a 4 ° C en una solución de bloqueo (5% de suero normal de cabra, un 0,3% Triton X-100, el 0,01% NaN3, y solución salina tampón Tris (TBS) a pH 7.4). A continuación, se incubaron con una dilución 1 / 50 de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-primaria Pax6 anticuerpos (Banco de Desarrollo del hibridoma) en TBS a un pH de 7.4 y 0,3% Triton X-100 durante 48 horas a 4 ° C. Los embriones fueron lavados tres veces con TBS y se incubaron a 4 ° C con el anticuerpo secundario (1 / 1000 conjugado con fluoresceína (FITC) antirratón IgG, Jackson ImmunoResearch) en TBS a pH 7,4, 0,3% Triton X-100, y el 3% suero de cabra normal durante al menos 12 hs. Por último, los embriones fueron lavados con TBS, colocados en una placa de cultivo de vidrio con 80% v / v de glicerol en el agua, y se fotografiaron. WMISH se realizó como se describe para los embriones de Xenopus, utilizando una sonda de c-shh.

Resultados El glifosato y los GBH modifican los marcadores de la cresta neural, los patrones romboidales, y la diferenciación neuronal primaria. Con el fin de examinar si el tratamiento con GBH puede afectar el desarrollo de la cresta neural, los patrones romboidales, y la diferenciación neuronal, embriones de Xenopus laevis en el estadio de dos células fueron expuestos a GBH, como se describe en los procedimientos experimentales, y ensayados para la hibridación in situ (WMISH) en el estadio de Néurula (estadio 1415). El marcador de cresta neural slug comienza su expresión tempranamente cuando la inducción de la cresta neural tiene lugar. En el estadio de néurula, se expresa en el territorio de la cresta neural (Figura 1 A, flechas) (35). Los embriones tratados muestran una importante baja regulación de slug en el territorio de la cresta neural (fig. 1B, flechas) en comparación con los controles mellizos. Para el estudio de los efectos sobre los patrones del cerebro posterior, se analizó la expresión del krox-20. Este factor de transcripción con dedos de zinc se expresa en los rombomeros R3 y R5 (Figura 1A) y se ha demostrado que juegan un papel importante

en el control de identidad rombomera (36). La franja R3 se perdió en los embriones tratados con GBH (fig. 1B). Esto se asemeja a la pérdida progresiva desde el rombomero anterior al posterior asociado con el aumento de las concentraciones de la AR en los tratamientos de Xenopus y embriones de ratones (37, 38). A continuación, se investigó la neurogénesis primaria en el estadio de la placa neural. En este momento, la N-tubulina se expresa normalmente en neuronas primarias diferenciada organizadas en tres regiones en el disco neural posterior: media, intermedia y laterales, las cuales corresponden a las neuronas motoras (m), las interneuronas (I), y las neuronas sensoriales (s), respectivamente (Figura 1C) (39). Los embriones tratados mostraron una baja regulación en los tres rayas de las neuronas primarias (Figura 1D). Para corroborar si el efecto es especialmente debido al principio activo de los herbicidas y no a los adyuvantes presentes en formulaciones, el glifosato fue inyectado en una célula, en el estadio de dos células y slug, krox-20 y N-tubulina se dieron a conocer en los estadios 14-15, como antes. Estos embriones mostraron una baja regulación del slug (Figura 1E, flecha), semejando los efectos del GBH sobre este marcador en este estadio del desarrollo. Aunque Krox-20 no desaparece por completo de R3 como en los embriones tratados con GBH, la expresión claramente disminuye en este rombomero así como en R5, lo que indica que el glifosato también altera patrones romboideales (Figura 1E, puntas de flecha). Normalmente, en el estadio 18 de la cresta neural ha formado tres bloques premigratorio de los cuales se segregan tres segmentos diferentes: segmento de la cresta mandibular, el segmento de cresta hioides, y segmento de cresta branquial (MCS, HCS, y BCS; Figura 1F).

Figura 1. GBH y el glifosato perturban la formación de la cresta neural, los patrones romboidales, y la diferenciación neuronal primaria. (A-G) Los embriones fueron analizados en el estadio de Néurula por WMISH con distintos marcadores. Todos son vistas dorsales (la parte anterior está arriba). (A, C) Los embriones de control. (B, D) Los embriones tratados con 1 / 5000 de dilución de GBH. (B) Deterioro en la formación de la cresta neural fue revelado por él marcador específico slug (flechas). Observe la baja regulación de krox-20 en región r3 del rombomero. Slug y krox-20 muestran baja regulación en el 87% de los embriones tratados (n=30). (D) La supresión de la formación de neuronas primarias como se ve con el marcador de diferenciación N-tubulina. El número de neuronas primarias disminuyó en un 83% de los embriones tratados (n =30). (E-G) Los embriones unilateralmente inyectados con 500 pg de glifosato por células más DOG como marcador. La parte inyectada está demarcada por la fluorescencia verde en los recuadros y se orienta hacia la izquierda. IS, lado inyectado. NIS, lado no inyectado. (E, F) Abolición de la expresión del slug en los dominios de la cresta neural craneal (flecha; 77%, n= 31) y disminución de la expresión krox-20 en los R3 y R5 (puntas de flecha, 71%, n=

21) del lado inyectado. (G) Reducción de la expresión Ntubulina del lado inyectada (81%, n= 16). r3, es el tercer rombomero; r5, quinto rombomero. m, i, y s, son el neurona primarias motoras, interneuronas y neuronas sensoriales, respectivamente. MCS, HCS, y BCS, son segmentos de la cresta mandibular, el segmento de cresta hioides, y segmento de cresta branquial, respectivamente.

El primer segmento contribuye con los cartílagos de Meckel, el cuadrado y etmoidal, el segmento de la cresta hioide contribuye al cartílago ceretohyal y el segmento branquial a los cartílagos de las branquias (40).Los embriones inyectados con glifosato mostraron que el proceso de segregación está claramente afectado en el costado inyectado (Figura 1F, flecha), lo que sugiere que los cartílagos derivados pueden ser afectados en los estadios posteriores durante el desarrollo. Cuando son hibridizados con la N-tubulina, estos embriones mostraron una disminución en el número de neuronas primarias en las tres franjas que corresponden a las neuronas motoras, interneuronas y las neuronas sensoriales (Figura 1G, flechas), semejando los efectos de los tratamientos GBH, aunque con menos consecuencias para este marcador.

Figura 2. GBH y el glifosato produce truncamientos A-P y poner en peligro la expresión de la línea media dorsal y los marcadores de la cresta neural. (A-I) Análisis WMISH a la Néurula (A-C) y los estadios tailbud (D-I). (A) Embrión de control hibridados con shh (flecha) y PAX6 (puntas de flecha blanca). (B-C) Los embriones expuestos a dilución 1 / 5000 de GBH. Nótese la drástica reducción de expresión de Shh en la línea media dorsal embrionaria (flechas) y el desplazamiento caudal del límite anterior (puntas de flecha verde) (85%, n= 33). La expresión de PAX6 se reduce, y el dominio no se resuelve adecuadamente en el campo visual (luz azul puntas de flecha) (85%, n= 33). (D, E), Embriones de control. (D) Expresión normal de Shh en la notocorda (n) la placa de piso, (fp), y mesodermo precordal (pm) y de Otx2 en el ojo (e), en el cerebro anterior (FB), y en el cerebro medio (Mb). El espacio entre las barras indica el tamaño del cerebro. (E) Expresión normal de SOX9 en arcos faríngeos (pa), placoda ótica (op), ojo (e), cresta genital (gr), y la notocorda (n). (F, G) Embriones tratados con 1/5000 de GBH. (F) reducción de expresión de Shh y Otx2 (92%, n= 24) en las células de la línea media dorsal (shh, flecha), mesodermo precordal (shh, punta de flecha negra), ojo (Otx2, punta de flecha amarilla), y las estructuras del cerebro (Otx2, el espacio entre las barras). (G) Disminución de la expresión SOX9 en el notocorda (flecha negra), cresta genital (flecha verde), y los ojos (color amarillo punta de flecha) (87%, n= 30). Nótese el retraso en la migración de las células de la cresta neural hacia los arcos faríngeos (puntas de flechas rojas). Embriones tratados (F y

G) mostraron microftalmia, microcefalia (compárese con el espacio entre las barras en D-G), y un acortamiento del eje AP (89%, n=54). (H, I) Embriones híbridados con shh y Otx2. (H) Embrión de Control muestrando las mismas estructuras que en D. (I) Embrión inyectado bilateralmente con 360 pg de glifosato por célula en el estadio de 2 células más DOG como trazador (fluorescencia verde en el recuadro). Similar a los embriones tratados con GBH, la expresión de shh y Otx2 fue reducida (62%, n=16), y esto fue acompañado por microcefalia (comparar el espacio entre barras) y microftalmia (punta de flecha amarilla).

En conclusión, los efectos en los embriones tratados con GBH e inyectados con glifosato representan fenotipos equivalentes a pesar del hecho de que no son idénticos. Los adyuvantes presentes en la formulación comercial pueden de explicar las diferencias. Tomado en conjunto, estos resultados indican que tanto GBH y el glifosato ponen en peligro la diferenciación neuronal, formación romboideal, y el patrón de la cresta neural durante la inducción y la segregación. GBH y el glifosato producen defectos en la cabeza e impiden la expresión de marcadores de la línea media dorsal y cefálica. Dado que los defectos craneofaciales se observaron en los seres humanos que residen en las zonas crónicamente expuestos a GBH, decidimos explorar si los genes que participan en el desarrollo de la cabeza son alterados como consecuencia del tratamiento con GBH o por inyección de glifosato. Shh actúa como un control morfogénico en múltiples procesos del desarrollo. Durante la embriogénesis temprana de vertebrados , shh es expresado en las estructuras de la línea media tales como notocorda, mesodermo precordal, y la placa de piso que controla la asimetría izquierda-derecha, la identidad neuronal, la supervivencia neuronal, y el patrón dorso-ventral del tubo neural (41, 42). Por otra parte, Shh secretado por el mesodermo precordal es responsable de la separación del cerebro y el campo de la ratina en dos hemisferios separados y los ojos, previniendo la ciclopía (43). Expresión de Shh se redujo drásticamente en la línea media dorsal en el estadio de Néurula, especialmente en el mesodermo precordal en embriones tratados con GBH .El dominio del límite anterior de la expresión de shh es movido caudalmente en embriones tratados en relación al dominio al PAX6 (compárese con puntas de flecha verde, Figura 2A-C). Pax6 es esencial para la formación de los ojos en una amplia gama de especies. Se expresa en el primordio del ojo de los vertebrados, como el ratón, el pollo, Xenopus, pez cebra, y los seres humanos, así como en invertebrados como Drosophila (4447). Los embriones incubados con GBH muestran un claro descenso de regulación del territorio PAX6 (compare puntas de flecha blanca, Figura 2A-C). Por otra parte, en los embriones tratados, el dominio PAX6 no está dividido en el campo visual (puntas de flecha de luz azul, la Figura 2B, C). Estos resultados sugieren que una baja regulación de la expresión de Shh en el mesodermo precordal junto con una disminución de la expresión Pax6 puede resaltar los defectos en la resolución del campo de la retina y en los hemisferios cerebrales en los embriones tratados con GBH. Para comprobar si estas alteraciones moleculares están asociadas con defectos en los estadios posteriores, se analizó la expresión de shh / Otx2 (Figura 2 D, F) y SOX9 (Figura 2 E, G) en los embriones tratados con GBH como antes, pero fijados en el estadio larva temprana. Otx2 es un gen con homeobox- expresado en los componentes de la retina y del cristalino del ojo y en las regiones telencefalicas, diencefálicas, y mesencefálica y juega un rol importante en la especificación de estructuras anteriores (48, 49). Embriones expuestos mostraron una disminución de la expresión shh anterior con microftalmia concomitante y microcefalia, según lo revelado por la reducción del dominio Otx2 (Figura 2, comparar el espacio entre las barras de control en el embrión D con el embrión tratado en F). Además, hay un pronunciado acortamiento del eje AP (comparar los embriones de control en la figura 2D, E con embriones tratados en F, G). En los embriones de control, el factor de transcripción SOX9 esta expresado en las células de cresta neural craneal así como ellos pululan los arcos faríngeos, la placoda ótica, el ojo en desarrollo, las cresta genital, y también la notocorda (Figura 2E) (50). Embriones tratados con GBH demostraron una reducción de los ojos y las cresta genital, y desarrollaron arcos la faríngeos anormales. La migración de las células de la cresta neural de estas

estructuras se retrasó, según lo revelado por una posición más dorsal (compare Figura 2G con E). Para analizar los efectos del glifosato solo sobre el desarrollo de la línea media dorsal, se realizaron inyecciones bilaterales en la en el estadio de dos células. Los embriones fueron fijados cuando los controles mellizos alcanzaron el estadio 28-30, y la expresión de Shh se analizó. Para una mejor entender los defectos cefálica, el patrón de Otx2 fue también examinado. Similar a los embriones tratados con GBH, observamos la expresión de shh precordal reducida acompañada por un fuerte fenotipo de microcefalia y microftalmia. Esto es como si fuera debido a una disminución de las señales derivadas de la línea media (Figura 2 H, I). Tomado en conjunto, todos estos resultados indican que GBH, así como el glifosato solo causan defectos cefálicos que probablemente sean resultado de una reducción de shh y expresión Otx2 en las estructuras anteriores. El retraso en la migración de las células de la cresta neural craneal en embriones en el estadio de larva temprana junto con la inhibición de la expresión del SLUG en los primeros estadios nos llevó a examinar a continuación si el desarrollo craneofacial podría haber sido impedido en embriones más viejos. GBH y glifosato perturban el desarrollo del Esqueleto craneofacial. El patrón de los derivados de la cresta neural en el esqueleto craneal del embrión de Xenopus fue previamente establecido (40). Brevemente, en el primer arco faríngeo, las células de la cresta neural contribuyen con la mandíbula superior de (cuadrado, Qu) e inferior (de Meckel, Me), en el segundo arco, contribuyen con el cartílago cerathoyal (Ce), mientras que en el tercer y cuarto arcos, las células de la cresta neural contribuyen con las regiones anterior y posterior del cartílago branquial (Br) y de las branqueas respectivamente (Figura 3C). Dirigido si el efecto visto en los estadios de Néurula y tailbud se están correlacionan con malformaciones craneofaciales, los embriones tratados con GBH y embriones inyectados unilateral o bilateralmente con glifosato en la estadio de dos células se les permitió desarrollar hasta el estadio 47y fueron procesados con la tinción de azul Alcian para análisis esqueletico. La morfología grosera de embriones tratados con GBH reveló una reducción global de las estructuras craneales y microftalmia (Compárese con la Figura 3 A, C y B, D). Todos los embriones afectados muestran una reducción de los cartílago cuadrados y de Meckel (asteriscos, la figura 3D), mientras que los cartílagos branquiales y cerathoyal fueron levemente afectados. Las inyecciones unilaterales de glifosato resultaron en una disminución general con la tinción con azul de Alcian y en una reducción de los cartílagos de Meckel y cuadrado en el lado inyectado (asteriscos, figura 3E, F).En algunos embriones, el ojo prácticamente desapareció del lado inyectado (flecha, Figura 3H). Por otra parte, los embriones inyectados bilíteramente presentaron ciclópea (Figura 3I, flechas), consistente con la pérdida de la señalización shh desde el mesodermo precordal observado en los estadios tempranos. Se obtuvieron resultados similares en embriones de rana tratados con ciclopamina (Figura 3J), un conocido inhibidor de la vía Hedgehog que conduce al desarrollo malformaciones del desarrollo y anomalías holoprosencefalia-, incluyendo ciclopía en los casos más graves (51-53). Inyecciones de ciclopamina unilaterales producen alteraciones del cartílago similares a las obtenidas con las inyecciones glifosato (no mostrado). En resumen, nuestros resultados son compatibles con las malformaciones observadas en los hijos de mujeres expuestas crónicamentea GBH durante el embarazo (ver Discusión). Estas malformaciones sugieren la pérdida de la señalización de la línea media, acompañado por defectos en la migración cresta neuronal (o aumento de la apoptosis), con desarrollo anormal de las estructuras mandibular y maxilar. Fenotipo inducido por GBH son al menos mediados por cambios en la señalización del AR. Fue previamente informado anteriormente que aumentos de las concentraciones del AR causaron truncacion progresiva en las estructuras anteriores y posteriores en Xenopus laevis (20, 21). Los embriones afectados más severamente carecían de los ojos, fosas nasales, cerebro anterior, cerebro medio, y las vesículas óticas y truncamientos dispersos en la cola. Los fenotipos producidos por GBH y el glifosato se asemejan a los efectos teratogénicos de los embriones tratados con AR; por lo tanto, teorizamos que la vía de la AR

podría estar asociada con los efectos morfogenéticos del glifosato durante la embriogénesis temprana.

Figura 3. Tratamiento con GBH y la inyección de glifosato resulta en malformaciones cefálicas y un desarrollo anormal del esqueleto craneofacial. (AD) Embriones tratados con 1/5000 de GBH analizados en el estadio 45-47. (A, B) Macro morfología. (A) Embrión control, los ojos (flechas), el tamaño de la cabeza (el espacio entre las barras de color amarillo). (B) embriones expuestos a GBH muestran una reducción de los ojos (flechas) y de las estructuras de la cabeza (89%, n=38) (comparar con el espacio entre las barras amarillas en A y B). (C, D) Los embriones teñidos con azul de Alcian. (C) Embrión Control, que muestra los cartílagos faciales: Meckel (Me), ceratohyal (Ce), infrarrostral (I), cuadrado (Qu), y branquial (Br). (D) Reducción de los cartílagos de Me y Qu (asteriscos) en embriones expuestos a GBH (77%, n= 39). (E-I) Los embriones inyectados con 360 pg de glifosato por célula en una o ambas células en el estadio de 2 células y se analizaron en el estadio 47 por tinción de azul de Alcian (E, F) Morfología gruesa (H, I), que se comparó con la de los controles hermano (G). (E, F) Embriones inyectados unilateralmente muestran una reducción de la tinción con azul de Alcian y cartílagos más pequeños Qu y Me (asteriscos) en el SE (56%, n=16). (G) Embrión de control. Las flechas indican la posición de los ojos. (H) Nótese la reducción de los ojos en el SE (flecha) (54%, n= 13). (I) Embriones inyectados bilateralmente exhibiendo ciclopía (flecha) (38%, n= 8). (J) Embriones tratados con Ciclopamina. Observe la proximidad de ambos ojos (Flechas), debido a defectos en línea media (comparar con el embrión de control en G). SE, lado inyectado. NIS, lado no inyectado. Glyinj, embriones inyectados con glifosato

La señal de la AR es traducida través de los receptores nucleares del ácido retinoico (RARs), que controlan la expresión de los genes diana involucrados en la formación de patrones de los vertebrados, la organogénesis, y homeostasis tisular (54). Ro 415253 (Ro) es un antagonista del receptor rarr, que se expresa durante el desarrollo temprano en Xenopus (16, 17, 55, 56). Ro se utilizó anteriormente como una herramienta para bloquear la señalización mediada por retinoides, produciendo una variedad de cambios morfológicos en el embrión de la rana. Los fenotipos más severos mostraron truncamientos anterior y posterior, una reducción o la pérdida de los ojos y las vesículas óticas, y una desorganización general de los arcos branquiales (22). Por otra parte, la insuficiencia materna de vitamina A (el precursor de la RA) o el ácido retinoico en exceso en vertebrados causan una amplia gama de efectos teratológicos (18, 57, 58).Toda esta evidencia demuestra que los vertebrados requieren un regulación precisa del suministro de retinoides durante la embriogénesis. Considerando que los fenotipos obtenidos en nuestro análisis semejan predominantemente aquellos del exceso de AR, nos preguntamos si los tratamientos del GBH son capaces de

incrementar la actividad AR endógena. Para responder a esta pregunta, medimos los niveles de señalamiento de AR aprovechando el plásmido reportero RAREZ (32), como se describe en la sección de Procedimientos experimentales. Figura 4 demuestra que el tratamiento con GBH aumentó significativamente el nivel de señalización de AR en el embrión en una manera dependiente de la concentración. Importantemente Ro el antagonista de los receptores AR rescata los efectos del GBH ya que el nivel de salida del AR medido por el método del reporter no fue significativamente diferente desde los inyectados con RAREZ y los controles no tratados (Figura 4). En conjunto, estas observaciones sugieren fuertemente que el GBH aumenta la actividad endógena del retinoide. Si un aumento en la señalización AR sostiene el fenotipo producido por los tratamientos de GBH antagonizando el camino del AR se rescatarían los efectos del GBH. Para examinar esta hipótesis, se incubaron embriones en el estadio de 2 células con GBH solo o con GBH junto con Ro uM 0,5 agregado cuando los controles mellizos alcanzan el estadio 9 (22). Embriones de rana fueron analizados en este aspecto morfológico y también fueron hibidizados con sondas shhy Otx2. Los Embriones de control mostraron una expresión de Otx2 en el cerebro anterior, medio y en vesícula la óptica, mientras que las transcripciones shh están distribuidas a lo largo de la línea media dorsal del embrión (fig. 4B). Embriones tratados continuamente con GBH mostraron una baja regulación de Shh y Otx2, la reducción de estructuras de la cabeza, y acortamiento del eje A-P (Figura 4C). Se obtuvieron resultados similares después de tratar embriones de rana con 0,1 micras o de un AR (21, 59, 60).Como fue previamente informado se (22), los embriones incubados con 0,5 o 1Ro uM solo también mostraron un acortamiento del del eje AP dependiente de la concentración y la reducción de las estructuras de la cabeza, las cuales fueron confirmadas por una reducción del dominio Otx2 (Figura 4 D, E; comparar el espacio entre las barras con B). También se observó una tinción más difusa de shh, principalmente en el mesodermo precordal, en comparación con la de los controles mellizos (Figura 4 D, E; flechas). Cuando se agregó Ro 0,5 o 1 uM en el estadio 9 a embriones continuamente expuestos a GBH en una dilución 1 / 5000, el alargamiento del eje AP fue recuperada, tanto como la expresión normal del patrón de Otx2 y shh (Figura 4F, G). Concluimos que la habilidad del tratamiento de Ro para rescatar los efectos teratogenicos del GBH sostiene la idea que la actividad del AR esta aumentada en los embriones tratados con GBH. GBH produce efectos teratogenicos similares en embriones

de pollo. Para comprobar si los efectos teratogénicos de GBH son reproducibles en vertebrados amniota, se optó por el modelo del pollo. Los embriones fueron incubados con GBH a unas diluciones 1 / 3500 o 1 / 4500 y analizados en el estadio de HH 9 (8 somitas) por inmunofluorescencia con un anticuerpo anti-Pax6 y por WMISH una sonda de c-shh (61). Como se ha demostrado previamente para Pax6ARNm (62), la proteína Pax6 se distribuye normalmente en la vesícula óptica, y en el distintivo de forma similar a un cometa en el ectodermo, posterior a la región de la vesícula óptica, en la parte posterior del cerebro rombomeros R3 y R5 y a lo largo de la médula espinal (Figura 5 A, D). Figura 4. El fenotipo inducido por GBH es mediado por el aumento de señalización AR (A). Análisis de la actividad de la AR con el plásmido reporter RAREZ. Todos los embriones fueron inyectados con el plásmido reporter RAREZ, a excepción de los controles no inyectados, y dejados sin tratamiento o fueron tratados como indica en la figura hasta el estadio 14-15, cuando fueron procesados. Los resultados son expresados como unidades de luminiscencia arbitraria por ug de proteína. Una prueba de dos colas T se utilizó para analizar el significado de la diferencia de los medios. ** P <0,01; *** p <0,0001. (B-G) WMISH para shh y Otx2 en los estadios tailbud. (B) Embrión de control. Notocorda (n); piso de la placa (fp); cerebro (el espacio entre las barras), ojos (cabeza de flecha). (C) Embriones tratados con 1/5000 de GBH manifestando microcefalia (espacio entre las barras), ojos reducidos (cabeza de flecha), disminución de la señalización de Shh del mesodermo precordal (flecha), y se acorta el eje AP (78%, n= 9). (D, E) Los embriones se incubaron con 0,5 y 1 mM del antagonista del AR Ro 41-5253, presentaron una reducción en el dominio Otx2 acompañado por microcefalia (barras) y microftalmia (cabeza de flecha), y más expresión difusa de Shh (flechas) (80%, n= 15 para Ro M 0,5; 87%, n= 15 para Ro Micromoles 1). (F, G) Los embriones tratados con 1 / 5000 de GBH en el estadio de2-células, 0,5 Micromoles Ro (F) o 1 Micromol Ro (G) fue agregado en el estadio 9, y los fenotipos fueron analizadas en el estadio de tailbud. Tenga en cuenta que Ro revierte el fenotipo producido por GBH, restituyendo la elongación del eje AP y la expresión de Shh y Otx2 (comparar con el embrión de control en B) (88%, n=17 de 0,5 Micromol de Ro, lo que da el mejor efecto de rescate ya que el efecto del antagonista retinoico comienza a imponerse con 1 Micromol de Ro). Todos los embriones están orientados con el extremo anterior hacia la derecha.

Figura 5. Los efectos teratogénicos de GBH en embriones de pollo. (A-C) Análisis por inmunofluorescencia de monto total de Pax6 en el estadio de ocho somitas. (A, D) embrión control que muestra la expresión de Pax6 en las vesículas ópticas(puntas de flecha en A) y rombomeros R3 y R5 (flechas azules en la D).(B, E y C, F) la reducción graduada de la expresión de Pax6 en los embriones tratados con 1 / 4500 y 1 / 3500 diluciones de GBH, respectivamente. Nótese microcefalia progresiva (compare el espacio entre las barras con D) y la pérdida de la expresión de Pax6 correspondiente a los rombomeros R3 y R5 (flechas rojas). La fluorescencia restante corresponde a la expresión especifica de Pax6 que es normalmente encontrada en la cuerda espinal, pero está fuera de foco en el embrión de control en D. (GI) WMISH con c-shh. (G)Embrión control. Las Transcripciones de Shh son vistas en las células de la línea media dorsal (flecha negra) y en el mesodermo precordal (flecha verde). (H, I) Los embriones tratados con 1 / 4500 y 1 / 3500 diluciones de GBH, respectivamente. Nótese la abolición de la expresión de Shh en el mesodermo precordal (flecha verde con puntos) y la disminución progresiva de la expresión de Shh en las células de la línea media en una manera dependiente de la concentración (flecha punteada en negro)

Tratamientos GBH produjeron una reducción dependiente de la concentración de las vesículas ópticas, como se revela por una reducción del correspondiente territorio Pax6, y esto fue acompañado por microcefalia (comparar el espacio entre las barras en la Figura 5B, C con A). También se observó una pérdida gradual de los territorios R3 y R5 en los embriones tratados con GBH (comparar Figura 5E, F con D), que se asemeja a los resultados observados en los embriones de rana en los dominios krox-20 (fig. 1B y 2E). La hibridación con la sonda de c-shh demostró que, como en el Xenopus, el territorio mesodermo precordal el preferentemente perdido en los embriones de pollo tratados con GBH (comparar Figura 5G con H, I). A medida que la concentración de GBH aumenta la expresión a lo largo de la línea media dorsal de embriones también desaparece gradualmente (Figura 5H, I). Vale decir que nuestros experimentos con embriones de pollo extienden nuestras conclusiones sobre los estudios los efectos teratogenicos del GBH de los anfibios a otras especies vertebrados.

Discusión Los resultados arriba mencionados argumentan que ambos el GBH y el glifosato por si mismos interfieren con los mecanismos moleculares fundamentales regulando el desarrollo temprano en los embriones de pollo y de Xenopus conduciendo a las malformaciones congénitas. Dosis Sub-letal del herbicida (μM 430 de glifosato en una disolución 1/5000 del GBH) e inyecciones que llevan a una concentración final de μM 8 a 12 de glifosato en el lado inyectado del embrión son suficientes para inducir serios disturbios en la expresión del Slugg, de Otx2, y del Shh. Estos fenotipos moleculares fueron correlacionados con una disrupción de los mecanismos de desarrollo que involucran la cresta neural, la formación de la línea media dorsal del embrión dorsal y los patrones cefálicos. Porque la penetración del glifosato a través de la membrana celular requiere de la facilitación de los coadyuvantes presentes en la formulaciones comerciales (5, 6), probamos los efectos del glifosato solo, por micro inyección directamente dentro del embrión del Xenopus. La semejanza de los fenotipos obtenidos en ambas situaciones sugiere que son atribuibles al principio activo de GBH y no de los coadyuvantes. Discutiremos nuestros resultados en el contexto siguiente: (1) la correlación de nuestros fenotipos con los observados en los animales modelos con una obstrucción de las señales AR o el déficit de la expresión de los genes críticos que controlan el desarrollo embrionario; (2) los mecanismos probables subyacentes a los fenotipos inducidos por el GBH y el Glifosato; (3) correlaciones posibles con los casos clínicos del descendencia humana que exhibían malformaciones en zonas que se expusieron a GBH. La mala regulación del AR, el Shh, y Otx2 están involucradas en fenotipos con malformaciones cefálicas y en los derivados de la cresta neural que recuerdan los efectos de GBH y del glifosato. Los fenotipos obtenidos después de efectuados los tratamientos de GBH o de inyecciones de Glifosato solo, son fuertemente evocadores de aquellos observados como consecuencia de un exceso de la señal del AR en vertebrados y seres humanos. El aumento agudo o crónico de los niveles del AR conduce a los efectos teratogénicos durante el embarazo humano y en modelos experimentales. Los hechos característicos por embriopatia por AR en seres humanos incluyen anormalidades del cerebro tales como microcefalia, microftalmia, y debilitación del desarrollo del cerebro posterior; oídos externos y medios anormales (microtia o anotia); subdesarrollo mandíbula y medio facial; y paladar de hendido. Muchas malformaciones craneofaciales se pueden atribuir a los defectos en las células de la cresta neural craneal (19, 24). Este espectro es consistente con los fenotipos obtenidos en los modelos del roedor expuestos a AR. Cuando se administra durante la gastrulación en ratones, el AR impide severamente el desarrollo de la placa neural anterior, dando por resultado malformaciones oculares, cerebrales, y faciales. La exposición en las etapas críticas de la migración de células en la cresta neural induce las malformaciones craniofaciales comparables aquellas vistas en el síndrome de Di-George. Exposiciones más tardías, cuando lA placoda epibranquial está activa resulta en síndromes de disostosismandibulofacial (19). Estos autores sugieren que la muerte celular

excesiva en las regiones donde tiene lugar normalmente la apoptosis puede ser la base de un mecanismo general para las malformaciones craneofaciales asociadas a los teratógenos. Un exceso de señales de AR es capaz de bajar la regulación de la expresión de shh en la línea media dorsal del embrión de Xenopus (60, 63). La deficiencia de Shh está asociada al síndrome de holoprosencefalia (HPE), una malformación del sistema nervioso centrar con una frecuencia de 1/250 de embarazos y a 1/10000 de nacimientos vivos. HPE es un defecto generado por la deficiencia de la línea media dorsal embrionaria, conduciendo a un fracaso en la división de los hemisferios cerebrales. Esto da lugar a cerebro unilobar, a ciclopia, y a defectos en el cierre del tubo neural dorsal, acompañado por otros defectos incluyendo microcefalia, distancia entre los ojos anormalmente disminuida (hypotelorism), probóscis, y cebocefalia (una nariz simple) (51-53). Por otra parte, la marcación de Shh es necesaria para el desarrollo de los derivados de la cresta neural craneal. En el ratón, la remoción específica de la respuesta del shh en la célula de la cresta neural da lugar a aumentos en el tejido conectivo y en la cabeza de la apostosis y disminuye la proliferación en los arcos branquiales, conduciendo a los truncaciones faciales (64). En el pez cebra, la cresta neural craneal requiere de la marcación de Shh emanando desde la línea media dorsal embrionaria y del ectodermo para alcanzar la migración correcta y el condrogenesis (65). En embriones del pollo, el desarrollo del esqueleto de la mandíbula inferior requiere la marcación de Shh desde el endodermo del intestino interior para prevenir la apoptosis de las células de la cresta neural que emigran hacia el al primer arco branquial (66). La marcación de Shh desde la línea media ventral es necesaria como un agente antiapoptotico, para la supervivencia del epitelio neural, y es también esencial para la expansión rápida y extensa de las vesículas tempranas del desarrollo del cerebro medio y anterior (67-69). Un exceso de la marcación del AR también baja la regulación de la expresión otx2 en embriones de Xenopus, pollo, y ratón (24). Los ratones knock out para otx2 carecen de todas las estructura cerebrales anteriores al rombomero 3. Interesantemente los mutantes heterocigotas demostraron malformaciones craniofaciales incluyendo la pérdida de los ojos y de la mandíbula inferior (agnathia). Estos fenotipos evocan el sindrome de la otocefalia descripto en seres humanos y otros animales y sugieren que otx2 desempeña un papel esencial en el desarrollo del esqueleto craneal originado en la cresta neural mesoencefalicos (70-72). Otx2, por otro lado, es necesario para la expresión del shh en el cerebro medio ventral (73). Toda esta evidencia indica que el señalar del AR, otx2, y el shh son parte de una cascada genética crítica para el desarrollo del cerebro y del esqueleto craniofacial del origen en la cresta neural. El Glifosato inhibe la expresión anterior del shh, reduce el dominio de otx2, previene la subdivisión del campo ocular, e impide el desarrollo craniofacial, asemejándose a aspectos de los síndromes de del holoprensecefalia y otocefalia. Esto nos incitó a investigar si un aumento de señalar del AR podría mediar los efectos de los tratamientos de GBH. GBH aumenta la actividad de morfógeno AR, conduciendo a los efectos Teratogenicos. En los embriones de Xenopus, la actividad endógena de retinoides aumenta gradualmente durante embriogénesis temprana y es finamente regulada en espacio. En la gástrula tardía una gradiente rostral-caudal desde 0.01 a 0.16 RA del μM de ácido retinoico esta establecido con los nivel más alto en la parte posterior del embriones. El gradiente persiste en la etapa temprana de neurula (estadio 13-14). La síntesis y la degradación del AR parece ser el mecanismo que conduce a esta distribución desigual (74). Este gradiente explica por qué las dosis bajas del AR aplicado afectan sobre todo la región cefálica y el aumento de las dosis comienza a afectar el tronco (20, 21). Por otra parte, mantener una distribución endógena normal del AR es importante para los patrones de alineamiento y la organogenesis no sólo en Xenopus (74, 22, 38) sino también en otros vertebrados tales como embriones de pez cebra (75-77), el pollo (78-80), y de ratón (81). En este estudio, los tratamientos de GBH o las inyecciones del glifosato reproducen sobre todo el fenotipo morfológico obtenido después de los tratamientos de los embriones de Xenopus con concentraciones del AR a partir de la 0.1 al 10 μM (21). El hecho que los tratamientos de GBH aumentan la actividad endógena del AR, fue medido por el reportero RAREZ, y ya que los fenotipos

inducidos por el GBH son contrarrestados por el Ro antiretinoico sugiere fuertemente que la actividad del AR es la causa mayor de los fenotipos moleculares y morfológicos descritos en este trabajo. Se considera a la GBHs como interruptor endocrino debido a su capacidad de impedir la síntesis de las hormonas esteroides (82). El glifosato inhibe la actividad de la aromatasa, un miembro de la familia del citocromo P450 crucial para la síntesis de hormona esteroide sexuales (4). La actividad de Retinoico es regulada por la degradación del AR por las enzimas CYP26, que son miembros de la familia del citocromo P450 y están presentes en todos los vertebrados desde los tempranos estadios de embriogénesis. La transcripción de CYP26 es regulada especialmente y en el desarrollo. Las deficiencias de esta enzima producen serias malformaciones en diferentes modelos vertebrados consistentes con un importante aumento en la señalización del AR. Estos fenotipos incluyen defectos cefálicos, las anormalidades del ojo y del cerebro anterior, agnatia y truncamientos caudales (83-90). En este contexto, será interesante aclarar en el futuro si el aumento del señalamiento de AR inducido por GBH podría ser una consecuencia de la inhibición de la actividad de las enzimas CYP26 responsables por el mantenimiento de una distribución normal del AR en la degradación de territorios específico. En Xenopus levis, el AR favorece la diferenciación de las neuronas primarias (39, 60, 91). Puesto que GBH aumenta la señalización de retinoico, la reducción en el número de neuronas primarias en embriones tratados con GBH e inyecciones de glifosato es paradojal. Otros mecanismos bioquímicos podían accionar la inhibición del neurogenesis. Por ejemplo, no podemos afirmar que la apoptosis de los precursores neurales podría estar involucrada en el proceso de puesto que GBH y el glifosato tiene un efecto tóxico sobre las membranas mitocondriales y de la caspases3/7 activada (7). Ambos el GBH y el Glifosato inhiben la expresión del shh, y la proteína de Shh es conocida por tener una función antiapoptotica, necesaria para la supervivencia del neuroepitelio (67, 68). La inducción anormal de la muerte de la célula es uno de los mecanismos cruciales de las malformaciones asociadas a diversos agentes teratogenicos tales como etanol, AR, hipoxia, y herbicidas químicos (19, 92). Asumiendo una respuesta lineal del sistema de luminescencia con el reportero RAREZ usado para medir la señal AR, nosotros estimamos que la concentración endógena del AR disponible para la actividad en los embriones de Xenopus es alrededor 0.2 μM (la figura 4A, compara efectos Teratogenicos de Glifosato quím. Res. Toxicol., vol. xxx, no. xx, barras del RA de G con la barra RAREZ). Esto es muy similar al promedio de concentración 0.15 μM previamente medidos por HPLC (20). Es importante señalar que, los tratamientos con dilución 1/5000 de GBH no demuestran un aumento significativo de la actividad del AR cuando son comparados con controles no tratados medido por el sistema de reporter (figura 4A). Sin embargo, esta dilución claramente producen fenotipos cefálicos y del tronco y malformaciones craniofacial, como son muestran a través de este trabajo, que son revertidas por tratamientos del Ro. Sin embargo el reportero de RAREZ no parece ser suficientemente sensible para detectar variaciones mínimas en los niveles de la actividad del AR. Esto refuerza la importancia de usar embriones vertebrados como biosensores para probar posibles teratógenos. Por otra parte, ha sido recientemente divulgado que el Triadimefon, un fungicida sistemico con efectos teratogenicos en modelos del roedor, produce malformaciones craniofaciales en Xenopus por alterar la señalización endógena del AR (93). Otro interruptor endocrino, el arsénico, también aumenta la señalización de AR en dosis bajas no citotóxicas en células NT2 de embriones humanos (94). El señalamiento del AR es uno de los caminos metabólicos más finos para poner en marcha la regulación de genes durante el desarrollo, y toda esta evidencia aumenta la posibilidad que disturbios en la distribución del AR pueda ser un mecanismo más general subyacente a los efectos teratogénicos del xenobioticos en vertebrados. Puesto que los mecanismos del desarrollo se conservan altamente en la evolución entre los vertebrados (95), quisiéramos mencionar que podrían ser útiles como biosensores muy sensibles para detectar los efectos indeseables de moléculas nuevas. Acercamientos clínicos. En la Argentina, la extensión del suelo dedicada a la soja transgenica alcanzó 19 millones de hectáreas. Doscientos millones de litros de herbicida basado en

glifosato se utilizan para una producción de 50 millones de toneladas de habas de la soja por el año (96, 97). Los modelos agrícolas intensivos y extensivos basados en el paquete tecnológico de OMG son corrientemente aplicados sin la evaluación crítica, regulaciones rigurosas, y adecuada información acerca del impacto de dosis subletales en salud humana y el ambiente, conduciendo a una situación conflictiva. En este trabajo, nos centramos en las dosis subletales de GBH para arribar al umbral para fenotipos teratogenicos en vez de letalidad. En los ultimos 10 años, varios países en América latina han iniciado estudios sobre las consecuencias ambientales del uso de herbicidas y de pesticidas. En Paraguay, un estudio epidemiológico en la descendiente de mujeres expuestas durante embarazo a los herbicidas demostró 52 casos de malformaciones (3), que se asemejan llamativamente al amplio espectro de fenotipos resultantes de una disfuncion del AR o del camino de señalamiento del Shh . En la Argentina, un aumento en la incidencia de malformaciones congénitas comenzó a ser divulgado en los últimos años (el Dr. Hugo Lucero, Universidad Nacional del Nordeste, Chaco; comunicación personal). En Córdoba, varios casos de malformaciones junto con abortos espontáneos repetidos fueron detectados en el pueblo de Ituzaingo, el cual es rodeado por agricultura basada en OGMs. Estos hallazgos fueron concentrados en familias que viven a pocos metros donde los herbicidas se rocían regularmente. Toda esta información es extremadamente preocupante ya que el riesgo de disrupciones inducidas ambientalmente en el desarrollo humano es muy alta durante el período crítico de la gestación (2 a 8 semanas) (98). Por otra parte, se ha demostrado que la placenta humana madura es permeable al glifosato. Después de 2.5 hs de perfusión, el 15% de glifosato administrado es transferido al compartimiento fetal (99). Toda la evidencia divulgada en la literatura científica y las observaciones clínicas en el terreno no son suficientes, sin embargo para activar el principio precautorio de la legislación ambiental en orden de analizar la profundidad del impacto en la salud humana producida por herbicidas en agricultura basada OGM. En nuestro conocimiento, los resultados presentes en este trabajo mostraron por primera vez que por lo menos algunas de las malformaciones producidas por GBH en embriones vertebrados son debido a un aumento de la actividad del AR endógeno, consistentes con el síndrome bien conocido producido por un exceso del RA. Reconocimientos. Reconocemos a los siguientes investigadores por proveernos las construcciones para hacer las prueba: David Wilkinson para krox-20, Michael Sargent para el lingote, Nancy Papalopulu para N-tubulin, bombardeo de Ira para otx2, Jean-Pierre Santo Jeannet para sox9, Thomas Hollemann para pax6, y acantilado Tabin para el c-shh. Son también agradecidos Abraham Fainsod para el plasmid de RAREZ, el Dr. M. Klaus por proporcionar Ro 41-5253, y Bruce Blumberg por las discusiones útiles. Agradecemos a Ana Adamo por ayuda, Hugo Rı´os, Ezequiel Varela, y Ernesto materiales Gonza´lez para ayudarnos con los experimentos del pollo, y a miembros de nuestro laboratorio (Cecilia Aguirre, Sabrina Murgan, y Diego Revinski) por ayudar con los embriones y las preparaciones el reactivo. También agradecemos a Carlos Davio y a Sandra Verstraeten por ayuda en la determinación del luminiscence. A.E.C. es particularmente endeudado a Bar de Cao. A.R.P. y A.E.C. sea de Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) y Universidad de Buenos Aires. V.G. fue apoyado por una beca de ANPCyT, y H.A fue apoyado por una beca de Universidad de Buenos Aires. S.L.L. es de CONICET. Este trabajo y los autores son totalmente independientes de industria. Los autores no declaran ninguna competición financiera.

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