CARACTERIZACIÓN FILOGENÉTICA DE UN NUEVO CURTOVIRUS AISLADO DE CHILE EN SAN LUIS POTOSÍ. *Salvador Ambríz-Granados, *+J. Armando Mauricio-Castillo y *Gerardo R. Argüello-Astorga. *Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, A.C. (IPICYT). Camino a la Presa San José 2055, Col. Lomas 4ª Sección, C.P. 78216 S.L.P. +Unidad Académica de Agronomía, U.A.Z, Apdo. Postal 336, 98000. Zacatecas, Zac.
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INTRODUCCIÓN.
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La familia Geminiviridae se divide en cuatro géneros, uno de los cuales, Curtovirus, agrupa a virus monopartitas que infectan dicotiledóneas y son transmitidos por la chicharrita de la remolacha (Circulifer tenellus). En la actualidad se conocen sólo 7 especies de curtovirus, la mayoría aisladas originariamente en los Estados Unidos. Lo anterior se debe en gran parte a la falta de un método molecular efectivo en la amplificación de los genomas de estos virus sin importar su origen geográfico ni la presencia de infecciones mixtas.
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MPM
3.0Kb 2.0Kb 1.6 Kb 1.0Kb
Figura 3. Productos de PCR amplificados a partir de extractos provenientes de plantas enfermas, con las combinaciones: 1) 1Kb, 2) CurV2Gen910 / CurRep2GQ, 3) RepQEW / CP450.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Figura 1. Genoma de Beet mild curly top virus (BMCTV) indicando las regiones amplificadas con cada combinación de iniciadores universales utilizados en este estudio.
METODOLOGÍA. Los iniciadores universales se diseñaron a partir de secuencias altamente conservadas presentes en los genomas de los curtovirus conocidos (Figura 1), e identificadas por medio del programa MegAlign (DNAstar, Inc). Los fragmentos de ADN viral amplificados a partir de plantas de chile con sintomas de virosis (Figura 2) fueron clonados en el vector pGEM-T easy (Promega), y secuenciados. Las secuencias se analizaron con los programas del paquete computacional DNAstar, y el programa BLAST del NCBI.
Diseñamos y evaluamos cuatro nuevos iniciadores universales para amplificar el genoma de curtovirus sin importar su origen geográfico. Se amplifico ADN viral a partir de extractos de plantas de chile variedad Pasilla, Serrano y Poblano colectadas en el estado de S.L.P. Con la combinación de iniciadores RepQEW / CP450 se obtuvieron amplicones de aprox. 1.7 Kb, y con el par de oligonucleótidos CurV2Gen910 / CurRep2GQ, se amplificó un fragmento genómico de 1.6 Kb (Figura 3). Los productos de PCR obtenidos comprenden la totalidad del genoma y se traslapan parcialmente en los genes Rep y CP. Se logró amplificar y caracterizar el genoma completo de un curtovirus cuya secuencia presenta una similitud global del 88.1% con su pariente mas cercano, Beet mild curly top virus-Worland (Figura 4) y, de acuerdo a los criterios taxonómicos establecidos por el ICTV, se define como una probable nueva especie, al cual denominamos Beet mild curly top virus-México (GenBank Accession No. EU193175). BMCTV-W.seq BMCTV-W4 .se q BMCTV-Mexico.seq PepYDV-N. Me xico.seq BSCTV-Cfh .se q PepCTV.se q SCTV.seq BCTV-Cal Lo gan.seq HrCTV.s eq BCTIran V.s eq
34.6 30 25 20 15 10 5 Nucleotide Substitutions (x100)
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Figura 4. Árbol filogenético que muestra la relación entre Beet mild curly top virus- México (BMCTV-Mexico) y los curtovirus conocidos.
CONCLUSIÓN.
Figura 2.- Síntomas de amarillamiento, enchinamiento, acucharamiento de la hoja y enanismo asociado a la presencia de Curtovirus en plantas de chile serrano recolectadas en el estado de S.L.P.
Este método representa un avance importante en las áreas del diagnostico molecular, la caracterización genómica y biológica de nuevas cepas y especies de curtovirus presentes aun en infecciones mixtas sin importar su origen geográfico.
