PRAKTIKUM ANALISIS PENYAKIT IKAN 1 BAB VIII UJI PATOGENITAS DAN POSTULAT KOCH A. Tujuan Untuk mengetahui konsentrasi bakteri patogen yang dapat mematikan 50% dan untuk membuktikan suatu bakteri sebagai penyebab penyakit

B. Dasar Teori PATOGENITAS Patogenitas adalah kemampuan suatu oragnisme untuk menimbulkan penyakit (Tortora, 2010). Bakteri patogen dapat menyebabkan penyakit apabila memiliki kemampuan untuk merusak jaringan (invasiveness) dan menghasilkan toksin (toxigenesis) (Todar, 2000). Tingkat patogenitas atau virulensi biasanya diukur dengan Lethal Dosis 50 LD50 atau Lethal Concentration 50 (LC50%). LD50 merupakan dosis bakteri yang diberikan kepada inang yang dapat mengakibatkan kematian pada populasi inang sebanyak 50% (Hubert, 1980). Menurut Reed dan Muech (1938) LD50 (50 percent lethal dose) adalah dosis yang dapat mematikan 50% dari jumlah hewan percobaan dalam waktu tertentu. Penentuan nilai LD50 menurut Reed dan Muech (1938) adalah :

Keterangan : m

: log LD50

Xi

: log dosis bakteri di bawah LD50

d

: selisih log dosis di bawah LD50 dan di atas LD50

%xi

: presentase kematian kumulatif pada dosis di bawah LD50

Xi 1

: presentase kematian kumulatif pada dosis di atas LD50

Bakteri memiliki tingkat virulensi yang berbeda-beda. Hal tersebut dipengaruhi oleh tingkat ketahanan ikan dan virulensi bakteri yang berbeda. Patogenitas dan patologi suatu bakteri sangat berkaitan dengan kemampuan bakteri dalam memproduksi enzim, toksin, cara mengatasi ketahanan inang, maupun kecepatan perkembangbiakan bakteri tersebut. Patogenitas pada umumnya dipengaruhi oleh perbedaan daya invasi dan jenis toksin yang dihasilkan oleh masing-masing bakteri. Daya invasi merupakan kemampuan bakteri untuk masuk kedalam jaringan dan menyerang pertahanan tubuh inang (Kamiso, 1996).

PRAKTIKUM API 1 | FAKULTAS PERIKANAN DAN KELAUTAN, UNIVERSITAS AIRLANGGA

PRAKTIKUM ANALISIS PENYAKIT IKAN 1 Menurut Angka (2001) dalam Abdullah (2008) penelitian tentang bakteri Aeromonas hydrophila telah banyak dilakukan dan diketahui bahwa bakteri ini mampu menghasilkan produk eksotoksin.Eksotoksin adalah protein yang dapat berdifusi dan diekskresikan dari sel bakteri ke dalam system peredaran darah dan jaringan inang.Aeromonas hydrophila menghasilkan berbagai toksin ekstraseluler atau enzim ekstraseluler yang merupakan faktor virulen.Produk ekstraseluler dari Aeromonas hydrophila terdiri atas hemolisin α dan β, protease, elastase, lipase, cytotoksin, enterotoksin, gelatinase, caseinase, lecithinase dan leucocidin.Pertumbuhan bakteri Aeromonas hydrophila yang cepat dan produksi ekstraseluler yang dihasilkannya adalah penyebab terjadinya gangguan fisiologis dan kematian ikan yang terinfeksi (Brenden dan Huizinga, 1986 dalam Abdullah, 2008). Davein pada tahun 1863-1868 membuktikan bahwa organism yang sakit antraks hanya terdapat pada organism yang sakit, dan penularan buatan menggunakan darah organism yang sakit pada organism yang sehat dapat menimbulkan penyakit yang sama. Pembuktian bahwa antraks disebabkan oleh bakteri dilakukan oleh Robert Koch pada tahun 1876, sehingga ditemukan “Postulat Koch” yang merupakan langkah-langkah yang membuktikan bahwa suatu mikroba adalah penyebab penyakit dan menjadi pedoman tetap yang dipakai dalam mengungkap suatu agen penyebab penyakit sampai kini.

Untuk memastikan bahwa bakteri yang diinfeksikan ke dalam tubuh ikan berasal dari bakteri yang diinokulasikan pada uji reinfeksi, maka dilakukan reisolasi bakteri dari ikan uji. Hal ini disebut Postulat Koch, yang pada tahun 1889 Koch memanfaatkan kemajuan metode laboratorium dan memnentukan kriteria yang diperlukan untuk membuktikan bahwa mikroba spesifik merupakan penyebab penyakit tertentu. Menurut Priyani (2003) kriteria ini dikenal dengan Postulat Koch, yaitu :

PRAKTIKUM API 1 | FAKULTAS PERIKANAN DAN KELAUTAN, UNIVERSITAS AIRLANGGA

PRAKTIKUM ANALISIS PENYAKIT IKAN 1 1. Mikroorganisme tertentu selalu ditemukan berasosiasi dengan penyakit yang ditimbulkan, 2. Mikroorganisme dapat diisolasi dan ditumbuhkan sebagai biakan murni di laboratorium, 3. Biakan murni tersebut bila diinjeksikan pada organism yang sesuai dapat menimbulkan penyakit, 4. Mikroorganisme tersebut dapat diisolasi kembali dari hewan yang telah terinfeksi tersebut. C. Alat dan bahan 

Spuit



Baskom



Vortex



Mikrotube



Lap



Isolate bakteri (Aeromonas hydrophila)



Ikan lele



Air

D. Cara Kerja 1. Siapkan alat dan bahan 2. Pisahkan 5 lele sebagai ulangan 1 dan 5 lele lainnya sebagai ulangan 2 pada wadah terpisah 3. Siapkan spuit dan vortex terlebih dahulu isolate yang akan digunakan, kemudian ambil isolate tersebut sebanyak 0,1 ml pada setiap ikan 4. Pelihara ikan selama 5 hari dan amati perubahan yang terjadi (dilakukan selang 6 jam setelah injeksi)

UJI POSTULAT KOCH Menurut Kamiso, 1989; Jawetz, et al,. 1996; Pelczar & Chan,1986. ), Setelah mendapat koloni yang murni, perlu dilakukan pengujian postulat Koch, untuk membuktikan apakah bakteri ini betul-betul sebagai penyebab penyakit. Infeksi dilakukan secara suntikan dengan kulture murni medium cair trypticase soy broth (TSB) volume 10 ml selama 24 jam dengan metode intraperitoneal sebanyak 0,1 ml/ekor. Postulat Koch dihentikan setelah 7 hari,

PRAKTIKUM API 1 | FAKULTAS PERIKANAN DAN KELAUTAN, UNIVERSITAS AIRLANGGA

PRAKTIKUM ANALISIS PENYAKIT IKAN 1 dan apabila tidak terjadi gejala penyakit atau kematian selama pengujian tersebut dilakukan maka isolat dianggap tidak bersifat patogen. a. Reinfeksi Gurami yang sehat dan bebas dari penyakit (SPF) dimasukan pada air bersih. Diaklimitasi selama 3 hari tanpa aerator, Sebanyak tiga ekor gurami diamati parasitnya menggunakan mikroskop, selanjutnya pada hari keempat gurami disuntik bakteri dengan kepadatan 0,1 ml/ekor sesuai ukuran ikan secara metode intraperitoneal. Selanjutnya kontrol disuntik dengan PBS dengan kepadatan 0,1 ml/ekor. Pengamatan gejala eksternal dan internal terhadap kemungkinan abnormal a) Pengamatan gejala eksternal Mengambil ikan yang diduga telah mengalami serangan penyakit bakteri Kemudian mencatat gejala-gejala eksternal bagian luar dari ikan seperti kulit, mata, sisik, sirip-sirip, pangkal sirip, dan mulut b) Pengamatan gejala internal Mencatat pengamatan terhadap target organ ginjal b. Reisolasi Hasil reinfeksi pada gurami (Osphronemus goramy) tersebut diseksio secara aseptis untuk diambil organ-organya seperti ginjal. selanjutnya diinokulasikan dalam medium TSA, GSP dan TCBS. Inkubasi dilakukan pada suhu 30oC selama 24 jam. Koloni bakteri yang tumbuh ditumbuhkan lagi di TSA miring yang akan digunakan untuk uji lanjut. c.

Pengamatan morfologi Identifikasi bakteri pada metode postulat Koch ini dilakukan dengan tujuan untuk membuktikan pengamatan morfologi koloni, morfologi bakteri, dan pengujian sifat biokimia hasil isolasi reinfeksi bakteri dari postulat Koch memiliki persamaan terhadap identifikasi sebelumnya.

d. rerata waktu kematian (MTD) Rerata waktu. kematian (Mean Time to Death, MTD) ikan pada uji Postulat Koch maupun uji patogenisitas diperhitungkan sebagai berikut:

PRAKTIKUM API 1 | FAKULTAS PERIKANAN DAN KELAUTAN, UNIVERSITAS AIRLANGGA

PRAKTIKUM ANALISIS PENYAKIT IKAN 1 MTD =

Keterangan: MTD = Mean Time to Death (rerata waktu kematian) aj

= waktu kematian pada jam ke-i (jam)

bi

= jumlah ikan uji yang mati pada jam ke-i (ekor)

Apabila hasil identifikasi menunjukan hasil yang sama baik morfologi koloni, morfologi bakteri, dan pengujian sifat biokimia antara identifikasi sebelumnya dan identifikasi pada postulat Koch maka pendugaan penyebab penyakit bakteri tersebut adalah benar adanya terserang penyakit bakteri.

PRAKTIKUM API 1 | FAKULTAS PERIKANAN DAN KELAUTAN, UNIVERSITAS AIRLANGGA