Protocol  for  Constructing  Guide  RNAs  Expression  Vectors  –  Joung  Lab  (February  2013)     Reagents  needed:   1. 10X  Annealing  Buffer  (recipe  for  making  1  ml):   a. 400  µl  1M  Tris  @  pH  8   b. 200  µl  1M  MgCl2   c. 100  µl  5M  NaCl   d. 20  µl  0.5M  EDTA  @  pH8   e. 280  µl  H2O   2. BsaI-­‐HF  restriction  enzyme  (New  England  Biolabs)   3. NEBuffer  4  (New  England  Biolabs)   4. T4  DNA  Ligase  (New  England  Biolabs)   5. 2X  Quick  Ligase  Buffer  (QLB)  (New  England  Biolabs)   6. Kanamycin   7. Chemically  competent  XL1-­‐Blue  cells.   Protocol:   1. Digest  pDR274  vector  (available  from  Addgene:   http://www.addgene.org/crispr/jounglab/CRISPRzebrafish/)  using  the  following  conditions:   a. 1  µg  of  pDR274   b. 5  µl  BsaI-­‐HF   c. 5  µl  NEB  4   d. H2O  to  50  µl     2. Gel  isolate  digested  pDR274  vector  backbone     3. Normalize  concentration  of  purified,  digested  vector  to  5  ng/µl  in  ddH20     4. Anneal  two  26  nt  oligonucleotides  (designed  using  the  web-­‐based  ZiFiT  Targeter  program   available  here:    http://zifit.partners.org)  in  a  thermocycler:   a. 1  µl  100  µM  Oligo  1   b. 1  µl  100  µM  Oligo  2   c. 5  µl  10X  annealing  buffer   d. 43  µl  H2O   e. 95  °C   f. -­‐1°C  per  30  seconds   g. 4  °C     5. Ligate  annealed  oligonucleotides  to  digested  pDR274  vector  backbone  as  follows:   a. 1  µl  backbone  (@  5ng/µl)   b. 3  µl  annealed  oligo   c. 1  µl  T4  DNA  Ligase   d. 5  µl  2X  QLB   1   Deepak  Reyon  

Protocol  for  Constructing  Guide  RNAs  Expression  Vectors  –  Joung  Lab  (February  2013)     Incubate  for  15  minutes  at  room  temperature   6. Transform  ligation  into  XL-­‐1  Blue  cells  as  follows:   a. 5  µl  of  ligation   b. 45  µl  of  chemically  competent  XL1-­‐Blue  cells     c. Ice  for  2  min   d. 42  °  C  for  45  seconds   e. Ice  for  2  min     f. Add  450  µl  of  LB  and  recover  at  37°C  with  shaking  for  1  hr   g. Plate  100  µl  on  LB  plates  containing  30  µg/ml  kanamycin     h. Grow  overnight  at  37°C     7. Inoculate  single  colonies  into  1ml  of  LB  supplemented  with  30  µg/ml  kanamycin     8. Grow  cultures  overnight  at  37°C     9. Isolate  plasmids  using  standard  mini-­‐prep  procedure     10. Sequence  candidate  plasmids  using  M13  primer  (see  Hwang  et  al.,  Nat  Biotechnol.  2013  for   sequence).    Full  sequence  of  plasmid  pDR274  is  available  here:     http://www.addgene.org/42250/sequences/.      

2   Deepak  Reyon