444

Medycyna Wet. 2008, 64 (4A)

Praca oryginalna

Original paper

Flora bakteryjna pochwy i macicy w ró¿nych fazach cyklu rujowego suk*) TOMASZ JANOWSKI, S£AWOMIR ZDUÑCZYK, IWONA BORKOWSKA, ANDRZEJ JURCZAK, MA£GORZATA PODHALICZ-DZIÊGIELEWSKA Zespó³ Rozrodu Zwierz¹t Katedry Nauk Klinicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UWM, ul. Oczapowskiego 14, 10-178 Olsztyn

Janowski T., Zduñczyk S., Borkowska I., Jurczak A., Podhalicz-Dziêgielewska M.

Vaginal and uterine bacterial flora at different stages of the estrus cycle in bitches Summary The aim of this study was to compare the bacterial flora of canine vagina and uterus and assess its composition during the estrus cycle. From 28 healthy bitches, vaginal smears and samples of uterine secretion by means of endoscopy were collected during the estrus cycle (anestrus, proestrus, estrus, metestrus) for bacteriological investigation. Similar bacterial flora were present in the vagina and uterus of bitches. Lactobacillus sp., a-hemolytic streptococci, Staphylococcus intermedius, Pasteurella multocida and E. coli were most frequently found. The average number of isolates was 2.2 per vaginal sample and 1.4 per uterine sample, the uterine samples also showed a lower bacterial count. The composition of vaginal and uterine bacterial flora and amounts of bacteria varied during the estrus cycle. The highest bacterial count occurred during proestrus. Keywords: bitches, bacterial flora, vagina, uterus, estrus cycle

Fizjologicznie w pochwie zdrowych suk znajduje siê flora bakteryjna, sk³adaj¹ca siê z bakterii komensalicznych i warunkowo chorobotwórczych. W jej sk³ad wchodz¹ g³ównie b-hemolizuj¹ce paciorkowce, Pasteurella multocida, E. coli i Staphylococcus intermedius, rzadziej stwierdzane s¹ Proteus sp., Pseudomonas sp., Haemophilus somnus i mykoplazmy (9, 15, 17). Przez wiele lat s¹dzono natomiast, ¿e bakterie nie wystêpuj¹ w macicy zdrowych suk (15). Dopiero niedawno w badaniach bakteriologicznych wymazów pobranych z macic suk poddanych eutanazji wykazano po raz pierwszy obecnoœæ bakterii w tym narz¹dzie u zwierz¹t bez objawów chorobowych (4). Przy¿yciowe pobieranie próbek z macicy do badania bakteriologicznego jest bardzo trudne ze wzglêdu na specyficzn¹ budowê pochwy i szyjki macicy suk. Jest to mo¿liwe dopiero przy zastosowaniu techniki endoskopowej (9, 17). Stwierdzono wystêpowanie ró¿nic w sk³adzie flory bakteryjnej pochwy w zale¿noœci od hodowli, z jakiej pochodzi³y suki oraz miêdzy rasami psów (5, 16). Niewiele dotychczas wiadomo o sk³adzie flory bakteryjnej w poszczególnych fazach cyklu p³ciowego. Problematyce tej poœwiêcono zaledwie kilka prac. Wynika z nich, ¿e faza cyklu p³ciowego wydaje siê wywieraæ wp³yw na zasiedlenie bakteryjne narz¹du rozrodczego suk (6, 9, 17). Prace dotycz¹ce wystêpowania bakterii w macicy suk i wp³ywu faz cyklu p³ciowego na sk³ad flory bakteryjnej pochwy i macicy s¹ nieliczne (4, 6, 9, 17), zaœ w kraju nie by³y dotychczas podejmowane. *) Badania wykonane w ramach grantu 3 P06K 01426 finansowanego przez MNiSzW.

Celem niniejszych badañ by³o porównanie zasiedlenia bakteryjnego pochwy i macicy suk oraz okreœlenie zmian w sk³adzie flory bakteryjnej tych narz¹dów w ró¿nych fazach cyklu rujowego.

Materia³ i metody Zwierzêta. Badania przeprowadzono na 28 sukach mieszañcach w wieku 3-7 lat o masie cia³a 7-20 kg. W okresie badañ zwierzêta przebywa³y w pomieszczeniach Zespo³u Rozrodu Zwierz¹t. ¯ywione by³y pe³noporcjow¹ karm¹ przemys³ow¹, raz dziennie. Zwierzêta mia³y wolny dostêp do wody i by³y wyprowadzane na spacer trzy razy dziennie. Okreœlanie faz cyklu rujowego. Próbki do badañ pobierano we wszystkich fazach cyklu rujowego: spokoju p³ciowego czyli bezrujowej (anoestrus), przedrujowej (prooestrus), rui w³aœciwej (oestrus) i porujowej (metoestrus). Okreœlano je badaniem klinicznym (ogl¹danie i omacywanie sromu, endoskopia pochwy), badaniem cytologicznym wymazów pochwowych oraz poprzez oznaczanie poziomu progesteronu w osoczu krwi (2, 19). Wymazy z pochwy pobierano przy pomocy ja³owych wymazówek (HAGMED S.C., Rawa Mazowiecka) z przedniego jej odcinka, po wprowadzenia wziernika pochwowego. Nastêpnie wykonywano rozmaz na odt³uszczonym szkie³ku podstawowym, utrwalano w mieszaninie alkoholu etylowego i eteru (1 : 1) i barwiono metod¹ Shorra (8). Preparaty oceniano w mikroskopie œwietlnym Olympus BX50F4. Próbki krwi (3 ml) pobierano z ¿y³y dostopowej do heparynizowanych probówek. Koncentracjê progesteronu w osoczu oznaczano metod¹ RIA opisan¹ przez Hoffmanna i wsp. (10). Czu³oœæ metody wynosi³a 1,34 nmol/l, zaœ zmiennoœæ wewn¹trz- i zewn¹trzseryjna, odpowiednio, 6,7% i 9,8%.

Medycyna Wet. 2008, 64 (4A)

445

Badania bakteriologiczne. Wyma- Tab. 1. Szczepy bakterii wyizolowane z pochwy i macicy suk w poszczególnych fazach zy z pochwy pobierano przy pomocy cyklu rujowego (% suk) ja³owych wymazówek (HAGMED F a za S.C., Rawa Mazowiecka) z przednieD robnoustrój bezrujow a przedrujow a rui w ³ aœ ciw ej porujow a go odcinka pochwy po wprowadzeniu wziernika. Nastêpnie umieszczano je pochw a macica pochw a macica pochw a macica pochw a macica w medium transportowym i bezP a s t e u r e l l a m u l t o c i d a 2 1 ,4 1 0 ,7 2 1 ,4 1 0 ,7 1 4 ,3 2 8 ,6 1 0 ,7 zw³ocznie przekazywano do badania bakteriologicznego w Pracowni Bak- Staphylococcus intermedius 2 8 ,6 2 1 ,4 1 7 ,1 1 0 ,7 2 1 ,4 3 9 ,3 1 4 ,3 teriologicznej Wojewódzkiej Stacji Streptococcus canis 3 9 ,3 1 7 ,1 1 4 ,3 Sanitarno-Epidemiologicznej w OlszE. coli niehemoliz. 1 4 ,3 1 7 ,1 tynie. Z macicy próbki do badañ bakte- E. coli hemoliz. 2 5 ,0 2 8 ,6 1 4 ,3 2 1 ,4 2 8 ,6 riologicznych pobierano przy pomo2 8 ,6 3 2 ,1 1 0 ,7 3 9 ,3 1 0 ,7 2 8 ,6 2 1 ,4 cy endoskopu i zestawu kateterów. Streptococcus sp. a -hemoliz. 71,4 W zale¿noœci od wielkoœci suki stoso- Actinomyces sp. 1 0 ,7 1 0 ,7 1 0 ,7 2 1 ,4 1 7 ,9 wano kompaktowy cystouretroskop 7 1 ,4 1 0 0 ,0 1 1 0 0 ,0 1 7 8 ,6 7 8 ,6 7 1 ,4 3 9 ,3 (Wolf GmbH, Knittlingen, Niemcy) Lactobacillus sp. lub histeroskop (Olympus, Hamburg, G ronkow ce koagulazoujemne 17,9 1 0 ,7 1 0 ,7 1 0 ,7 Niemcy). Po odka¿eniu sromu ja³owy Micrococcus sp. 1 4 ,3 1 0 ,7 2 1 ,4 1 4 ,3 1 0 ,7 endoskop wprowadzano do pochwy 1 0 ,7 1 7 ,1 1 7 ,1 pod fa³d grzbietowy. Po uwidocznie- Enterococcus sp. niu czêœci pochwowej szyjki wprowa- Bacillus sp. 1 4 ,3 1 0 ,7 1 0 ,7 1 7 ,1 dzano przez jej kana³ kateter zewnêtrz7 ,1 1 0 ,7 1 7 ,1 1 4 ,3 1 0 ,7 ny (Arrow, Reading, USA) z mandry- Inne nem na 3-5 cm do macicy. Po usuniêciu mandrynu wprowadzano kateter wewnêtrzny (Balton, WarTabela 3 przedstawia liczebnoœæ izolatów z pochwy szawa) na taka odleg³oœæ, aby jego koniec wystawa³ oko³o i macicy suk w cyklu rujowym. Wynika z niej, ¿e liczba 2 cm z kateteru zewnêtrznego. Nastêpnie infundowano do ma- kolonii uzyskiwanych z wymazów pochwowych by³a cicy 2 ml ja³owego p³ynu fizjologicznego i zasysano go po- wiêksza ni¿ z próbek pobranych z macicy, w których najnownie do strzykawki. P³yn umieszczano w ja³owej probówce czêœciej obserwowano nieliczny wzrost bakterii. Bardzo i przekazywano niezw³ocznie do badania bakteriologicznego. liczne izolaty stwierdzano jedynie w próbkach pobranych Bli¿sze szczegó³y dotycz¹ce techniki endoskopii narz¹du rodz macicy w fazie przedrujowej. nego u suk zawarte s¹ we wczeœniejszej pracy w³asnej (7). W Polsce nie przeprowadzono dotychczas badañ nad Badania bakteriologiczne wykonywano wed³ug rutynowych wystêpowaniem bakterii w pochwie i macicy zdrowych metod. W kierunku mikroflory tlenowej próbki posiewano na suk. Dostêpne dane dotycz¹ jedynie zwierz¹t z zaburzebulion, agar zwyk³y, agar z krwi¹, pod³o¿e Levina, Chapmana niami procesów rozrodu i maj¹ fragmentaryczny charaki Sabourauda. Pod³o¿a inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 godziny (pod³o¿e Chapmana przez 48 godzin, Sabourouda ter. Birger i Staroniewicz (5) izolowali z pochwy suk przez 5 dni), nastêpnie sporz¹dzano rozmazy i barwiono meto- z zespo³em endometritisd¹ Grama. Pa³eczki Gram-ujemne identyfikowano przy pomo- -pyometra g³ównie szcze- Tab. 2. Œrednia liczba izolatów cy szeregu biochemicznego i testów firmowych ID 32 E i ID py E. coli (75% przypad- z pochwy i macicy suk w po32 GN (Bio-Merieux), zaœ gronkowce i paciorkowce za pomo- ków), natomiast znacznie szczególnych fazach cyklu ruc¹ testów Slidex Staph-Kit i Slidex Strepto-Kit A, B, C, D, F, rzadziej Streptococcus sp. jowego G (Bio-Merieux). W kierunku flory beztlenowej posiewy wy- (15,7% suk). ŒmielewskaFaza cyklu P ochw a Macica konywano na pod³o¿a Szedlera i Wrzoska, które inkubowano -£oœ i wsp. (16) izolowali rujow ego w atmosferze CO2 (system Genbo-anaer, Bio-Merieux) w tem- z pochwy suk z problemaB ezrujow a 2 ,3 1 ,0 peraturze 37°C przez 48 godzin. mi rozrodu w oko³o 40% Liczebnoœæ izolatów okreœlano wed³ug nastêpuj¹cego scheP rzedrujow a 2 ,6 1 ,8 matu: poni¿ej 30 kolonii – nieliczne, 30-100 kolonii – liczne, przypadków czyste kultu1 ,9 1 ,4 ry Staphylococcus aureus, R ui w ³aœ ciw ej powy¿ej 100 kolonii – bardzo liczne.

Wyniki i omówienie Tabela 1 przedstawia szczepy bakterii wyizolowane z pochwy i macicy suk w poszczególnych fazach cyklu rujowego. Stwierdzono, ¿e sk³ad flory bakteryjnej pochwy i macicy suk ulega³ znacz¹cym zmianom w przebiegu cyklu rujowego, polegaj¹cych na znikaniu pewnych rodzajów bakterii oraz pojawianiu siê nowych. W tab. 2 podano œredni¹ liczbê izolatów z pochwy i macicy suk w poszczególnych fazach cyklu rujowego. Z próbek pobranych z pochwy izolowano we wszystkich fazach cyklu rujowego wiêcej szczepów bakteryjnych ni¿ z macicy. Przeciêtnie izolowano z pochwy 2,2 szczepy bakteryjne z jednej próby, natomiast z macicy 1,4.

Staphylococcus intermedius, Streptococcus zooepidemicus i E. coli. W bada-

P orujow a

2 ,1

1 ,4

O gólem

2 ,2

1 ,4

Tab. 3. Liczebnoœæ izolatów z pochwy i macicy suk w cyklu rujowym Faza cyklu rujow ego

N ieliczne

Liczne

B ardzo liczne

pochw a macica pochw a macica pochw a macica

S pokoju p³ ciow ego

5 2 ,1

6 6 ,7

4 3 ,5

3 3 ,3

2 4 ,3

–

P rzedrujow a

5 0 ,0

4 4 ,4

2 3 ,1

3 3 ,3

2 6 ,9

2 1 ,2

R ui w ³ aœ ciw ej

5 7 ,9

6 0 ,0

2 6 ,3

4 0 ,0

1 5 ,8

–

P orujow a

6 1 ,9

1 0 0 ,0 1

1 4 ,3

–

2 3 ,8

–

446

niach nad wystêpowaniem bakterii w macicy suk z zespo³em endometritis-pyometra stwierdzano g³ównie szczepy E. coli, znacznie rzadziej paciorkowce i gronkowce (5, 13, 18). Generalnie trudno jednak porównywaæ bakteryjne zasiedlenie pochwy i macicy suk zdrowych i dotkniêtych ciê¿kimi stanami patologicznymi. W badaniach w³asnych wykazano wystêpowanie bakterii w pochwie u wszystkich zwierz¹t, co pokrywa siê z wynikami innych autorów (6, 9). Natomiast Olson i Mather (15) nie stwierdzili obecnoœci bakterii w pochwie u 37% badanych suk, a Allen i Dongal (1) u 14% zwierz¹t. W badaniach w³asnych do najczêœciej izolowanych z pochwy suk szczepów bakterii nale¿a³y Lactobacillus sp., paciorkowce a-hemolizuj¹ce i Staphylococcus intermedius. Podobne szczepy bakterii stwierdzali w pochwie zdrowych suk tak¿e inni autorzy (1, 6, 9, 15). W badaniach w³asnych wykazano równie¿ obecnoœæ bakterii w macicy wszystkich zwierz¹t. Dane piœmiennictwa na ten temat ró¿ni¹ siê znacznie. Mather i Olson (15) nie stwierdzili w ogóle wystêpowania bakterii w macicy zdrowych suk, natomiast Baba i wsp. (4) pobierali wymazy z macic suk poddanych eutanazji i wyizolowali bakterie z 70% próbek. Tak¿e w badaniach, w których stosowano endoskopowe techniki pobierania próbek z macicy, stwierdzono wystêpowanie drobnoustrojów w tym narz¹dzie u zdecydowanej wiêkszoœci suk (9, 17). W macicy wystêpowa³y podobne szczepy bakterii jak w pochwie, ale z próbek pobranych z macicy izolowano mniej szczepów bakteryjnych w porównaniu do wymazów pochwowych, a liczba uzyskanych kolonii by³a mniejsza. Podobieñstwo flory bakteryjnej pochwy i macicy suk podkreœlaj¹ równie¿ inni autorzy (4, 9, 17). W fazie spokoju p³ciowego w pochwie i macicy wystêpowa³o niewiele bakterii. Z narz¹dów tych izolowano w tym okresie g³ównie szczepy paciorkowców a-hemolizuj¹cych, Pasteurella multocida i gronkowców koagulazoujemnych. W fazie przedrujowej nast¹pi³ wzrost liczby bakterii zarówno w pochwie, jak i macicy. W sk³adzie flory bakteryjnej macicy pojawi³y siê szczepy Staphylococcus intermedius, Streptococcus canis, Enterococcus sp. i hemolizuj¹ce szczepy E. coli. Zmiany te œwiadcz¹ o migracji bakterii z pochwy do macicy i s¹ zapewne wynikiem rozwarcia szyjki macicy pod wp³ywem wzrastaj¹cej w tej fazie cyklu rujowego koncentracji estrogenów (11). W fazie rui w³aœciwej stwierdzono eliminacjê z macicy szczepów Pasteurella multocida i E. coli. By³o to przypuszczalnie zwi¹zane z antagonistycznym oddzia³ywaniem bakterii z rodzaju Lactobacillus. Pod wp³ywem estrogenów w komórkach nab³onkowych nastêpuje bowiem wzrost zawartoœci glikogenu, który jest naturalnym substratem dla pa³eczek kwasu mlekowego. Jest on przez nie rozk³adany, w wyniku czego powstaje kwas mlekowy i nastêpuje obni¿enie pH. Zjawisko to odgrywa wa¿n¹ rolê w mechanizmach obronnych narz¹du rodnego, zapobiegaj¹c nadmiernemu namna¿aniu siê patogennych bakterii (3). Estrogeny wydaj¹ siê równie¿ zwiêkszaæ odpornoœæ nieswoist¹ organizmu zwierz¹t. Powszechnie znane jest, ¿e w okresie rui macica zwierz¹t jest ma³o wra¿liwa na zaka¿enia bakteryjne (12, 14). W fazie porujowej obecnoœæ bakterii w macicy by³a mniejsza. By³o to przypuszczalnie zwi¹zane z ograniczeniem mo¿liwoœci ich migracji z pochwy do macicy. Wzrost koncentracji progestero-

Medycyna Wet. 2008, 64 (4A)

nu w tej fazie cyklu powoduje bowiem zamkniêcie szyjki macicy (11). W badaniach w³asnych œrednia koncentracja progesteronu w fazie porujowej wynosi³a 38,5 ± 9,8 nmol/l. Odpowiada³a ona wartoœciom podawanym przez innych autorów (2, 11). W piœmiennictwie jest niewiele informacji poœwiêconych wystêpowaniu bakterii w pochwie i macicy suk w przebiegu cyklu rujowego. Stwierdzono, ¿e w okresie cieczki nastêpuje wzrost liczebnoœci bakterii w pochwie suk (1). W okresie przedrujowym izolowano istotnie czêœciej szczepy Pasteurella multocida i b-hemolizuj¹cych paciorkowców ni¿ w pozosta³ych fazach cyklu p³ciowego (6). Wykazano te¿, ¿e zmianom ulega równie¿ sk³ad flory bakteryjnej macicy (9, 17). Potwierdzaj¹ to wyniki uzyskane w badaniach w³asnych. Z przeprowadzonych badañ wynika, ¿e w przebiegu cyklu rujowego wystêpuje zmiennoœæ sk³adu i liczebnoœci flory bakteryjnej pochwy i macicy suk. Jest to przypuszczalnie zwi¹zane ze zmianami hormonalnymi zachodz¹cymi podczas cyklu rujowego, które wywieraj¹ wp³yw na warunki panuj¹ce w uk³adzie rozrodczym oraz na narz¹dow¹ i ogóln¹ odpornoœæ nieswoist¹ zwierz¹t. Wydaje siê, ¿e z punktu widzenia etiopatogenezy bakteryjnych schorzeñ macicy, istotne znaczenie mo¿e odgrywaæ wzrastaj¹ce zasiedlenie macicy drobnoustrojami w okresie przedrujowym i rui w³aœciwej bêd¹ce skutkiem otwartej szyjki macicy. Zaka¿enie bakteryjne macicy uznawane jest za istotny czynnik w rozwoju ropomacicza u suk (5, 19).

Piœmiennictwo 1. Allen W., Dagnall G. J. R.: Some observations on the aerobic bacterial flora of the genital tract of the dog and bitch. J. Small. Anim. Pract. 1982, 23, 325-335. 2. Arbeiter K.: Anwendung von Hormonen in der Reproduktion von Hund und Katze, [w:] Döcke E. (red.): Veterinärmedizinische Endokrinologie. Gustav Fischer Verlag, Jena-Stuttgart 1994, 823-841. 3. Askienazy-Elbhar M.: Vaginal flora and genital infections. Validity of 2 markers: vaginal pH and flora score. Gynaecol. Obstet. Fert. 2000, 28, 502-508. 4. Baba E., Hata H., Fukata T., Arakawa A.: Vaginal and uterine microflora of adult dogs. Am. J. Vet. Res. 1983, 44, 606-609. 5. Birger M., Staroniewicz Z.: Rola bakterii w zespole endometritis-pyometra u suk. Medycyna Wet. 1996, 52, 245-248. 6. Bjurström L., Linde-Forsberg C.: Long-term study of aerobic bacteria of the genital tract in breeding bitches. Am. J. Vet. Res. 1992, 53, 665-669. 7. Borkowska I., Jurczak A., Leœnik M., Janowski T.: Endoskopia dróg rodnych suk. Medycyna Wet. 2003, 59, 297-299. 8. Dreier H.-K.: Genitaltrakt. [w:] Kraft W., Dürr U. M. (red.): Klinische Labordiagnostik in der Tiermedizin. Schattauer Verlag, Stuttgart, New York 1999, 201-211. 9. Günzel-Apel A.-R., Lübke A., Rohde J.: Vergleichende Untersuchung der vaginalen und uterinen Zytologie und Keimflora im Sexualzyklus und Puerperium von Beaglehündinnen. Tierärztl. Praxis 1999, 27(K), 112-119. 10. Hoffmann B., Kyrein H. J., Ender M. L.: An efficient procedure for the determination of progesterone by radioimmunoassay applied to bovine peripheral plasma. Hormone Res. 1973, 4, 302-310. 11. Hoffamnn B., Riesenbeck A., Klein R.: Reproductive endocrinology of bitches. Anim. Reprod. Sci. 1996, 42, 275-288. 12. Hussain A. M., Daniel R.: Studies on some aspects of neutrophil functions and uterine defenses in cows during the estrous cycle. Reprod. Dom. Anim. 1991, 26, 290-296. 13. Krzy¿anowski J., Wawron W., Krakowski L., Kostro K., Wrona Z., Szczubia³ M., Piech T., Kusy R.: Badania nad stanem nieswoistych mechanizmów obronnych u suk z ropomaciczem. Medycyna Wet. 2000, 56, 382-385. 14. Nomura K., Masooka K., Shimada Y.: Experimental production of canine pyometra by inoculation with E. coli into the uterus with the cervix not ligated. J. Jap. Vet. Med. Assoc. 1988, 41, 95-99. 15. Olson P. N., Mather E. C.: Canine vaginal and uterine bacterial flora. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1978, 172, 708-711. 16. Œmielewska-£oœ E., Klimentowski S, Rypu³a K.: Udzia³ zaka¿eñ herpeswirusowych, chlamydiowych i bakteryjnych w niep³odnoœci u suk. ¯ycie Wet. 1997, 72, 17-19. 17. Watts J. R., Wright P. J., Whithear K. C.: Uterine, cervical and vaginal microflora of the normal bitch throughout the reproductive cycle. J. Small Anim. Pract. 1996, 37, 54-60. 18. Wernicki A., Krzy¿anowski J., Puchalski A.: Characterization of Escherichia coli strains associated with canine pyometra. Polish J. Vet. Sci. 2002, 5, 51-56. 19. Zduñczyk S., Janowski T.: Zaburzenia rozrodu psów i kotów. UWM, Olsztyn 2002.

Adres autora: prof. dr hab. Tomasz Janowski, ul. Oczapowskiego 14, 10-718 Olsztyn; e-mail: [email protected]