UNIVERSITETI BUJQËSOR I TIRANËS FAKULTETI I BUJQËSISË DHE MJEDISIT DEPARTAMENTI I SHKENCAVE DHE TEKNOLOGJIVE BIMORE

VLERËSIMI I METODAVE ANALITIKE PËR ANALIZAT E DISA PMB-VE DHE PËRCAKTIMI I NIVELIT TË MBETJEVE TË TYRE NË VENDIN TONË.

Doktoranti: MSc. Vjollca VLADI

Udhëheqës shkencor: Prof. Dr. Fatos HARIZAJ

“COPYRIGHT I VJOLLCA VLADI 2015”

2

“Udhëheqësi i Vjollca Vladi vërteton se ky është versioni i miratuar i disertacionit të mëposhtëm”

VLERËSIMI I METODAVE ANALITIKE PËR ANALIZAT E DISA PMB-VE DHE PËRCAKTIMI I NIVELIT TË MBETJEVE TË TYRE NË VENDIN TONË.

Prof. Dr. Fatos HARIZAJ

3

VLERËSIMI I METODAVE ANALITIKE PËR ANALIZAT E DISA PMB-VE DHE PËRCAKTIMI I NIVELIT TË MBETJEVE TË TYRE NË VENDIN TONË

Përgatitur nga Msc. Vjollca Vladi

“Disertacioni i paraqitur në: Fakulteti i Bujqësisë Universiteti Bujqësor i Tiranës Në përputhje të plotë Me kërkesat Për gradën Doktor”.

Universiteti Bujqësor i Tiranës Prill, 2015 4

“MIRËNJOHJE” Në pamundësi për ti përmendur të gjithë ekspertët që më kanë ofruar ndihmë dhe më kanë ndihmuar realisht, do të falenderoja shumë udhëheqësin tim të disertacionit Prof. Dr. Fatos HARIZAJ, për ndihmën e pakursyer si në drejtimin metodiko – shkencor, dhe në atë profesional për realizimin e këtij studimi. Falenderime të veçanta për Prof. Dr. Valdete VORPSI dhe Prof. Dr. Magdalena CARA për konsulencën në fushën e mbetjeve të pesticideve si dhe për realizimin me sukses të eksperimenteve të paraqitura në këtë studim. Me shumë dashuri do të vlerësoja punën e bërë nga stafi i Laboratorit të mbetjeve të Pesticideve në Institutin e Sigurisë Ushqimore dhe Veterinarisë, Tiranë. Falenderime, për Departamentin e Shkencave dhe Teknologjive Bimore që më krijoi mundësinë për mbrojtjen e disertacionit.

Vjollca

5

Deklaratë mbi origjinalitetin

Vjollca Vladi

Deklaroj se kjo tezë përfaqëson punën time origjinale dhe nuk kam përdorur burime tw tjera, përveç atyre të evidentuara nëpërmjet citimeve.

Të gjitha të dhënat, tabelat, figurat dhe citimet në tekst, të cilat janë riprodhuar prej ndonjë burimi tjetër, duke përfshirë edhe internetin, janë pranuar në mënyrë eksplicite si të tilla.

Jam e vetëdijshme se në rast të mospërputhjeve Senati i UBT-së është i ngarkuar të më revokojë gradën “Doktor”, që më është dhënë mbi bazën e kësaj teze, në përputhje me “Rregulloren e programeve të studimit të ciklit të tretë (Doktoratë) në UBT”, neni 27, datë 10 Maj 2012.

Tiranë,Prill 2015

_____________ Firma

6

PËRMBAJTJA PËRMBLEDHJE ....................................................................................................................................10 KAPITULLI I. HYRJE DHE QËLLIMI I STUDIMIT ..........................................................12 1.1 PESTICIDET DHE ROLI I TYRE ........................................................................................................12 1.1.1

Historiku i përdorimit të pesticideve në bujqësi dhe në shëndetin publik ...........................12

1.1.2

Ndikimet e përdorimit të pesticideve në bujqësi dhe shëndetin publik ................................12

1.1.3

Efektet anësore të përdorimit të pesticideve për mjedisin dhe shëndetin publik .................13

1.2 MBETJET E PESTICIDEVE DHE SIGURIA USHQIMORE............................................................13 1.2.1

Rëndësia e Përcaktimit të mbetjeve të pesticideve ..............................................................13

1.2.2

Akreditimi .............................................................................................................................14

1.3 RËNDËSIA E DOMATES ......................................................................................................................14 1.4 RËNDËSIA E SPECIT ............................................................................................................................14 1.5 QËLLIMI DHE OBJEKTIVAT E STUDIMIT.....................................................................................15

KAPITULLI II. BAZAT TEORIKE TË STUDIMIT ..............................................................17 2.1PESTICIDET NË BOTËN MODERNE DHE TENDENCA NË ANALIZIMIN E TYRE .................17 2.1.1

Faktorët që ndikojnë në sjelljen e pesticideve .....................................................................17

2.1.2

Vetitë e pesticideve ..............................................................................................................17

2.1.3

Kondicionimi i tokës: ..........................................................................................................19

2.2 VETITË E PËRGJITHSHME FIZIKE TË PESTICIDEVE ...............................................................19 2.2.1

Klasifikimi i pesticideve bazuar në përbërjen kimike ..........................................................19

2.2.2

Pesha molekulare dhe forma ...............................................................................................20

2.2.3

Presioni i avujve (VP) .........................................................................................................20

2.2.4

Tretshmëria .........................................................................................................................20

2.2.5

Koeficienti i ndarjes oktanol/ujë - Kow (Log Kow) ................................................................21

2.2.6

Koeficienti adsorbimit të tokës Koc/kd ..................................................................................21

2.2.7

Konstantja e ligjit të Henrit -H` ..........................................................................................22

2.3 REAKSIONET KARAKTERISTIKE TË PESTICIDEVE .....................................................................22 2.3.1

Reaksioni i reduktimit të pesticideve ...................................................................................22

2.3.2

Reaksioni i hidrolizës së pesticideve ...................................................................................22

2.3.3

Fotodegradimi i pesticideve ................................................................................................23

2.3.4

Biodegradimi .......................................................................................................................23

2.4 NEONIKOTINOIDET ............................................................................................................................23 2.4.1

Historiku i Neonikotinoideve ................................................................................................23

2.4.2 Çfarë janë Neonikotinoidet? ......................................................................................................24 2.4.3 Mekanizmi i veprimit të Neonikotinoideve.................................................................................25

7

2.4.4 Përfaqësuesit e Neonikotinoideve ..............................................................................................26 2.5 IMIDAKLOPIRIDI .................................................................................................................................27 2.5.1 Efektet e dëmshme dhe simptomat .............................................................................................27 2.5.2 Përshkrimi i Imidaklopiridit ......................................................................................................28 2.5.4 Vetitë fizike dhe kimike ..............................................................................................................28 2.5.5 Përdorimi: .................................................................................................................................28 2.5.6 Mënyra e Veprimit: ....................................................................................................................29 2.6 ACETAMIPRIDI ....................................................................................................................................30 2.6.1 Përdorimi dhe Aplikimet ............................................................................................................30 2.6.2 Dëmet endokrine ........................................................................................................................31 2.6.3 Toksiciteti oral dhe dermal ........................................................................................................31 2.7 TEKNIKAT KROMATOGRAFIKE .....................................................................................................32 2.7.1 Metoda Gaz kromatografike ......................................................................................................32 2.7.2 Metoda e kromatografisë së lëngët HPLC, LC-MS ...................................................................34 2.8 VLERËSIMI I METODËS .....................................................................................................................35 2.8.1 Parametrat e performancës së metodës analitike Instrumentale ...............................................36

KAPITULLI III. MATERIALI DHE METODA.......................................................................39 3.1 VENDNDODHJA E EKSPERIMENTIT ..............................................................................................39 3.2 PËRMBAJTJA E PESTICIDEVE NE TOKËN E SERRAVE PARA TRAJTIMIT .........................40 3.2.1 Metoda e analizimit të mbetjeve të pesticideve në tokë .............................................................41 3.3 NGRITJA E EKSPERIMENTIT ...........................................................................................................42 3.3.1 Skema e ngritjes së eksperimentit për studimin e zbërthimit të lëndëve aktive acetamiprid në spec dhe imidakloprid në domate në mjedise të mbrojtura ...........................................................42 3.3.4 Ekstraktimi dhe veçimi...............................................................................................................45 3.4. METODA E EKSTRAKTIMIT KADENCZKY ..................................................................................46 3.4.1. Parimi i metodës: .....................................................................................................................46 3.4.2 Përpunimi i mostrave.................................................................................................................47 3.4.5 Sistemi gaz kromatografik (për acetamipridin) .........................................................................48 3.4.6 Sistemi lëng kromatografik (për imidaclopridin) ......................................................................49 3.5 METODA E EKSTRAKTIMIT ME ETIL ACETAT (SWEET) ...........................................................49 3.5.1 Hapësirat e aplikimit-matricat ..................................................................................................49 3.5.2 Parimi i metodës ........................................................................................................................49 3.5.3. Reagentet dhe kimikatet ............................................................................................................49 3.5.4. Mjetet ........................................................................................................................................50 3.5.5 Ekstraktimi .................................................................................................................................50 3.6 METODA QUECHERS (UNI EN 15662:2009) ....................................................................................51 3.6.1 Fusha e përdorimit ....................................................................................................................51 3.6.2 Parimi i metodës ........................................................................................................................51 3.6.3 Reagentët ...................................................................................................................................51

8

3.6.4 Materialet/ Pajisjet ....................................................................................................................52 3.6.5 Mënyra e veprimit ......................................................................................................................53 3.6.6 Ekstraktimi i kampioneve...........................................................................................................54 3.6.7 Pastrimi i kampionëve ...............................................................................................................55 3.6.8 Përgatitja e lakoreve standarde (të zakonshme) në matrica ......................................................56 3.6.9 Përgatitja e lakoreve standarde (të zakonshme) në solventë .....................................................56 3.6.10.Analizat GC-MS .......................................................................................................................57 3.6.11 Analizat LC MS-MS .................................................................................................................59 3.6.12 Njehsimi i përqëndrimit të analitëve ........................................................................................60 3.6.13 Njehsimi i sasisë së rikuperuar të analitëve ............................................................................60 3.7 PËRPUNIMI STATISTIKOR I REZULTATEVE ...............................................................................70 3.7 VLERËSIMI I METODËS ....................................................................................................................72 3.7.1 Plani i vlerësimit........................................................................................................................72

KAPITULLI IV. REZULTATE DHE DISKUTIME ...............................................................74 4.1 REZULTATET MBI VLERËSIMIN E PARAMETRAVE TË METODAVE . .................................74 4.1.1 Metoda Kadenczky: ...................................................................................................................74 4.2

REZULTATET

MBI

VLERËSIMIN

E

PARAMETRAVE

TË

METODËS

SË

EKSTRAKTIMIT ME ETIL ACETAT (METODA SWEET) .....................................................79 4.3 REZULTATET E VLERËSIMIT TË METODËS QUECHERS..........................................................82 4.3.1 Optimizimi I Kushteve Instrumentale HPLC-MS/MS ................................................................82 4.3.2 Optimizimi I Kushteve Instrumentale GC-MS/MS .....................................................................83 4.3.3. Lineariteti dhe efekti matricë ....................................................................................................84 4.3.4 Ripërsëritshmëria, LOD dhe LOQ .............................................................................................88 4.3.5 Specificiteti ................................................................................................................................92 4.4 KRAHASIMI NDËRMJET TRE METODAVE. ..................................................................................92 Metoda Kadenczky..............................................................................................................................93 Metoda e ekstraktimit me etil acetat (SweEt) .....................................................................................94 Metoda QuEChERS ............................................................................................................................94 4.5

REZULTATET

MBI

VLERËSIMIN

E

MBETJEVE

DHE

DEGRADIMIN

E

ACETAMIPRIDIT NË SPEC ........................................................................................................95 4.6 KONKLUZIONE MBI DEGRADIMIN E ACETAMIPRIDIT NË SPEC ........................................98 4.7REZULTATET MBI VLERËSIMIN E MBETJEVE TË IMIDAKLOPRIDIT NË DOMATE. .......98 4.7.1 Ecuria e degradimit të imidaklopridit në domate ....................................................................100

4.8 KONKLUZIONE MBI DEGRADIMIN E IMIDAKLOPRIDIT NË DOMATE ...........................102 4.9 REZULTATET E MBETJEVE TË PESTICIDEVE NË PARCELËN EKSPERIMENTALE ....103

PËRFUNDIME ......................................................................................................................................105 LITERATURA ..........................................................................................................................................1064

9

PËRMBLEDHJE Siguria e prodhimeve të freskëta është një çështje globale që mbulon në të njëjtën kohë vendet që importojnë fruta dhe perime të freskëta dhe vendet që i eksportojnë ato. Duke pasur parasysh rolin e prodhimeve të freskëta në një dietë të shëndetshme, është e rëndësishme që këto ushqime të jenë maksimalisht të sigurta. Nga njëra anë njerëzit janë të inkurajuar që të konsumojnë më shumë perime dhe fruta, duke qenë këto një burim i mirë i vitaminave, fibrave dhe gjithashtu i dobishëm për shëndetin e tyre. Dhe nga ana tjetër, masmedia me të drejtë kërkon të krijojë një ndërgjegjësim, por shpesh të shprehur gabimisht dhe të zmadhuar, në lidhje me problemet mjedisore dhe shëndetësore si dhe rrezikun që mund të vijë nga përdorimi i pesticideve në bujqësi. Rrjedhimisht, kjo ka krijuar një shqetësim dhe pasiguri në publik, për praninë ose jo të mbetjeve të pesticideve në ushqimin e tyre të përditshëm. Analizimi i mbetjeve të pesticideve përbën një prioritet sidomos në aspektin e mbrojtjes së konsumatorit. Për këtë qëllim duhet të jenë të disponueshme metoda të shpejta, të sakta dhe me kosto të ulët për të lejuar monitorimin e tyre. Kontrolli i mbetjeve të pesticideve në produktet ushqimore përfshin një numër të madh mostrash. Kosto e reagentëve dhe koha e nevojshme për analizë përbën pjesën më të madhe të kostos totale të kontrollit të tyre. Ky studim, në pjesën e parë të tij, përshkruan zhvillimin dhe vlerësimin e metodave të analizimit të mbetjeve të pesticideve duke synuar një rezultat të shpejtë, me kosto të ulët dhe të besueshëm. Numri i faktorëve që duhet të merren në konsideratë për përzgjedhjen e metodës për analizën e mbetjeve të pesticideve është i madh. Ndër to mund të përmendim së pari qëllimin e analizimit: në qoftë se është për një pesticid individual, një klasë kimike e pesticideve, një numër i madh i pesticideve të klasave të ndryshme kimike, apo edhe për përfshirjen e produkteve të tyre të transformimit. Faktorë të tjerë përfshijnë karakterisitikat fiziko-kimike dhe molekulare për secilin pesticid, ku përfshihen: pika e vlimit; polariteti; tretshmëria në tretësin e dëshiruar ose fazën e lëvizshme; stabiliteti i tyre në portën e injektimit, në kolonë, apo në burimin e joneve të mas-spektromatësit; selektiviteti i kolonave dhe sjellja kromatografike e tyre; interferencat në identifikim; struktura molekulare ose veti të tjera kimike të rëndësishme për procesin e jonizmit dhe fragmentimit; kufiri i detektimit të metodës ose kërkesat rregullatore për nivelet e lejuara; dhe aftësia konfirmatore e metodës (Raina, 2011). 10

Rezultatet e vlerwsimit treguan që të treja metodat e ekstraktimit (metoda Kadenczky, metoda me etil acetat dhe metoda QuEChERS) plotësojnë të gjithë parametrat e performancës të nevojshme për të analizuar mbetjet e pesticideve në matricat me origjinë bimore. Të treja metodat e përdorura në këtë studim janë të vlefshme për analizimin e mbetjeve të pesticideve në matricat me origjinë bimore, por metoda më e thjeshtë, më pak e kushtueshme, më e shpejtë e saktë dhe gjithashtu që mbulon një numër të madh pesticidesh në të njëjtën kohë është metoda QuEChERS. Duke patur parasysh evoluimin e vazhdueshëm në përdorimin e pesticideve që përdoren në bujqësi, është e lehtë për të kuptuar rëndësinë e të pasurit në dispozicion metoda të analizës së shumë mbetjeve, të zbatueshme për një gamë të gjerë të substancave me karakteristika të ndryshme kimike-fizike në drejtim të polaritetit, paqëndrueshmërisë dhe fortësisë. Në këtë kontekst, zbatimi i teknikave kromatografike shoqëruar me spektrometrinë e masës tani ka marrë një rol kyç në përcaktimin e mbetjeve të pesticideve në ushqim për konsum njerëzor. Llogaritjet dhe përpunimi statistikor janë kryer duke u bazuar në formate të certifikuar nga laboratorë të akredituar në bazë të standardeve ISO/IEC 17025:2005. Në pjesën e dytë të studimit paraqiten rezultatet e eksperimenteve të kryera gjatë studimit, ku përfshihen:  Analizimi dhe përcaktimi i mbetjeve të Imidaklopridit në domate.  Analizimi dhe përcaktimi i mbetjeve të Acetamipridit në spec.  Shkalla e degradimit të këtyre pesticideve në dy doza të rekomanduara trajtimi (minimale dhe maksimale) dhe krahasimi i tyre me nivelin maksimal të lejuar të mbetjeve referuar standardeve Evropiane për NML-të. Studimi mbi degradimin e këtyre dy pesticideve të përdorur me dy dozat e rekomanduara të trajtimit i shërben më së miri fermerëve shqiptarë për të njohur kohën e vjeljes së produktit përfundimtar duke respektuar në këtë mënyrë legjislacionin mbi nivelet maksimale të lejuara të mbetjeve dhe sigurinë e konsumatorit. Perspektiva dhe e ardhmja është padyshim përmirësimi i performancës së teknikave analitike në dispozicion sot, dhe zgjerimi i mëtejshëm i gamës së substancave të monitoruara për të siguruar nivele më të larta të mbrojtjes për shëndetin e njeriut

11

KAPITULLI I. HYRJE DHE QËLLIMI I STUDIMIT 1.1 PESTICIDET DHE ROLI I TYRE Edhe pse pesticidet janë të domosdoshme në bujqësi, përdorimi dhe keqpërdorimi i tyre mund të çojë në probleme të rënda përsa i takon cilësisë ujit, shëndetit të peshqve, dëmtimit të riprodhueshmërisë së shpendëve dhe shëndetit të njeriut. Kontaminimi i ujërave nëntokësore, gjithashtu është një problem potencial pas përdorimit normal të pesticideve. (Kamrin, 2000) Pas aplikimit të pesticideve mund të ndodhin shumë gjëra. Ato mund të merren nga bimët dhe/ose gëlltiten nga kafshët, insektet, krimbat, ose mikroorganizmat e tokës; mund të shkojnë në tokë dhe të lidhen në grimcat e tokës, ose mund të treten; mund të avullojnë; mund të shpërbëhen në komponime më pak toksike; mund të lëvizin nga bima në rrënjë me anë të shiut apo ujitjes; ose mund të largohen nga erozioni. (Waxman, 1998)

1.1.1 Historiku i përdorimit të pesticideve në bujqësi dhe në shëndetin publik Sfondi historik i përdorimit të pesticideve në bujqësi datohet që në fillimet e vetë bujqësisë dhe u bë më e theksuar me kalimin e kohës për shkak të rritjes së popullatave të egra dëmtuese paralel me uljen e pjellorisë së tokës (Muir, 2002) Megjithatë, përdorimi i pesticideve në bujqësi dhe në shëndetin publik ka filluar që në fillimet e shekullit 19-të. Ndër pesticidet e para të përdorura kanë qenë komponime shumë helmuese, arseniku (arsenat kalciumi dhe plumbi) dhe cianidi I hidrogjenit tymosës për kontrollin e dëmtuesve të tillë si kërpudhat, insektet dhe bakteret. Përbërjet e tjera përfshinin përzierjet Bordo (sulfat bakri, gëlqere dhe ujë) dhe squfur. Përdorimi i tyre u braktis për shkak të toksicitetit dhe efektshërisë së ulët. Brezi i dytë i pesticideve përfshin përdorimin e komponimeve sintetike organike. Pesticidi i parë sintetik organik i rëndësishëm ishte diklordifeniltrikloretani (DDT) i cili është sintetizuar për herë të parë nga shkencëtari gjerman Ziedler në 1873 (Othmer, 1996) dhe efekti i tij si insekticid u zbulua nga kimisti zviceran Paul Muller në vitin 1983.

1.1.2 Ndikimet e përdorimit të pesticideve në bujqësi dhe shëndetin publik Përdorimi i pesticideve në bujqësi ka çuar në një rritje të ndjeshme të prodhimit për hektar. Studimet kanë krijuar një marrëdhënie të mundshme paralele midis sasisë së pesticideve të përdorura dhe sasisë së prodhimit për hektar (Hellar, 2002). Ekonomitë janë rritur, rendimentet në kulturat bujqësore janë rritur jashtëzakonisht, dhe kështu janë ulur vdekshmëritë nga sëmundjet

12

për shkak të mungesës së ushqimit. Nga ana tjetër, insekticidet kanë shpëtuar jetën e miliona njerëzve nga sëmundjet e shkaktuara nga insektet (Youdeowei, 1983).

1.1.3 Efektet anësore të përdorimit të pesticideve për mjedisin dhe shëndetin publik Pavarësisht nga rezultatet e mira të përdorimit të pesticideve në bujqësi dhe shëndetin publik të përshkruara më sipër, përdorimi i tyre është shoqëruar edhe me dëme mjedisore dhe publike. Pesticidet mbajnë një pozitë të veçantë në mesin e ndotësve të mjedisit për shkak të aktivitetit biologjik dhe toksicitetit (akut dhe kronik) të lartë të tyre.

1.2

MBETJET E PESTICIDEVE DHE SIGURIA USHQIMORE

Pesticidet mund të përdoren në mënyra të ndryshme gjatë prodhimit të ushqimit. Ato mund të përdoren nga fermerët për të kontrolluar rritjen e barërave të këqija, ose për të parandaluar dëmtimin e të mbjellave nga insektet, brejtësit dhe myqet. Ato mund të përdoren edhe pas vjeljes për të zgjatur jetën e tyre të magazinimit. Pesticidet gjithashtu mund të përdoren në fermat e kafshëve për të kontrolluar insektet e dëmshme ( Gandhi & Snedeker, 1999). Ndonjëherë, sasi të vogla të pesticideve të përdorura në këto mënyra mund të gjenden në ushqime. Pesticidet që gjenden në ushqime janë quajtur "Mbetje". Disa pesticide, madje edhe ato që nuk përdoren më, vazhdojnë dhe mbeten në mjedis. Mbetjet e këtyre pesticideve janë gjetur ndonjëherë në bimët e rritura në tokën e kontaminuar, ose në peshqit që jetojnë në ujërat e kontaminuar ( Gandhi & Snedeker, 1999).

1.2.1 Rëndësia e Përcaktimit të mbetjeve të pesticideve Larg nga të qenit një fushë e pjekur analitike, përcaktimi I gjurmëve të pesticideve vazhdon të jetë një temë objektiv për analistët që punojnë në qëndra kërkimore, institucione qeveritare dhe universitete. Kjo është pasojë e (i) komponimeve të reja, bazuar në struktura të reja kimike, të cilat vazhdimisht futen në treg, (ii) rregulloret e reja, të cilat janë duke u bërë gjithnjë e më kufizuese në lidhje me limitet maksimale të mbetjeve të lejuara ligjërisht në ushqim, dhe (iii) një rritje e interesimit social, ekonomik dhe akademik për sigurinë ushqimore, e cila ka implikime të rëndësishme tregtare. Përderisa mbetjet e pesticideve janë një shqetësim në lidhje me, sigurinë dhe besimin e konsumatorëve, tregtisë së ushqimit, vendimet e kontrolleve rregullatore varen shumë nga cilësia e analizës. Kështu, laboratorët që merren me analizimin e mostrave të ushqimit për përcaktimin e mbetjeve të pesticideve duhet të jenë të sigurtë për cilësinë e të dhënave të tyre. Vlerësimi i

13

performacës analitike (validimi) të metodës së përdorur është thelbësore për të vërtetuar që metoda është e përshtatshme për qëllimin e përdorur ( Gandhi & Snedeker, 1999). Si pasojë e karakteristikave specifike të pesticideve (psh. numri i madh i komponimeve, karakteristikat jashtëzakonisht të ndryshme fizike dhe kimike, nivelet analitike shumë të ulëta, etj) teknikat me bazë kromatografinë janë qartësisht zgjedhja e vetme e analistit (Alba, 2004).

1.2.2 Akreditimi Në shumë vende të botës, tani është e detyrueshme që laboratorët e mbetjeve duhet të plotësojnë kërkesat e një skeme të njohur të akreditimit, që zakonisht kërkon respektimin e kërkesave të ISO 17025. Shumë vende e kanë njohur nevojën për akreditim dhe kërkesat e tregtisë globale janë duke udhëhequr të tjerët në vijim. Edhe pse kërkesa të caktuara të akreditimit mund të duken të tepruara pak ose jopraktike për laboratorët e mbetjeve, akreditimi ka qenë një forcë e fuqishme lëvizëse në zbatimin dhe përmirësimin e standardeve të cilësisë. Një aspekt i rëndësishëm i dokumentacionit të akreditimit është përdorimi i Procedurave Operative Standarte (POS), të cilat përshkruajnë parimet e punës dhe si ajo duhet kryer (Alba, 2004). 1.3 RËNDËSIA E DOMATES Domatja (Lycopersicon esculentum) është një ushqim i rëndësishëm si dhe burim të ardhurash për shumë fermerë. Domatja është një ushqim i freskët, popullariteti i së cilës është gjithmonë në rritje dhe prodhimi global i domates arrin në 80 milion ton (INTA, 2002).dhe prodhimi vjetor vendas shkon mesatarisht në 45384 ton (vjetari statistikor 2012 MBZHRAU). Fermerët shqiptarë për cdo vit kanë probleme me kultivimin e domates për shkak të infeksioneve të ndryshme që e prekin atë. Këto sëmundje shkaktojnë ulje të prodhimit dhe të cilësisë së domates të prodhuar në Shqipëri. Për këtë arsye një shumëllojshmëri pesticidesh përdoret në sera për të ruajtur një prodhimtari të lartë të kulturës së domates. 1.4 RËNDËSIA E SPECIT Speci (Capsicum annum L.) gjithashtu wshtw një nga perimet më me rëndësi në vendin tonë, si në Tiranë, Durrës, Fier, Shkodër, Korçë, etj. Zë një sipërfaqe prej më shumë se 3060 ha, me prodhim rreth 44.192 ton e rendiment prej 150 kv/ha, si nga fushat e hapura dhe nga serat (vjetari statistikor 2012 i MBZHRAU). Sëmundjet më të rrezikshme për kulturën e specit konsiderohen kalbëzimi i qafës së kërcellit shkaktuar nga Phytophora capsici, dhe verticilloza shkaktuar nga Verticillium dahlie, të pranishme si në kultivimin në fushë të hapur edhe në atë në serra.

14

Ndër dëmtuesit potencial që prekin bimën e specit, përmendim afidet dhe krahëbardhën e serave (Trialeurodes vaporariorum). Krahëbardha e serave është një insekt që vepron njëkohësisht edhe si vektor i sëmundjeve virusale. Kjo flutur tepër e pranishme në mjedise të mbrojtura, luftohet me insekticide si Imidacloprid, Methomyl, Acetamiprid, Oxamyl etj (Collins & Fryer,2003). Vjelja e shpejtë e domates dhe e specit (më pak se 3 ditë) është kritike për kultivuesit të cilët i mbledhin ato vetëm me qëllim që të përmbushin kërkesat e konsumatorëve. Prandaj kultivuesit duhet të kryejnë një vlerësim rrisku para se të aplikojnë ndonjë pesticid dhe të respektojnë intervalet e korrjes sa më shumë të jetë e mundur për të siguruar që mbetjet të jenë nën nivelin maksimal të lejuar (NML). Kërkesa kryesore e tregut është ende përsosja e prodhimit të produkteve sa më të lirë e cilësorë dhe disponueshmëria e tyre përgjatë gjithë vitit. Mbetjet e pesticideve varen nga dy faktorë: 1. Depozitimet fillestare dhe 2. Shkalla e shpërbërjes së pesticidit (dhe e metaboliteve të tij) Ndaj studimi i shkallës së shpërbërjes së pesticideve që përdoren në vendin tonë si në serra ashtu edhe në mjedise të hapura është e një rëndësie të madhe pasi i krijon mundësi fermerit të ketë informacionin e domosdoshëm mbi kohën e vjeljes së produkteve që prodhon dhe tregton.

1.5 QËLLIMI DHE OBJEKTIVAT E STUDIMIT Në vendin tonë nuk ka ende një traditë në studimin e mbetjeve të pesticideve në produktet me origjinë bimore. Studimet mbi mbetjet e pesticideve kanë qënë vetëm në kuadër të kërkimeve shkencore për qëllime të kualifikimeve të niveleve të ndryshme. Metodat e përdorura për këtë qëllim janë metoda klasike të ekstraktimit, pastrimit dhe përcaktimit. Këto metoda janë shumë të zgjatura në kohë, kanë efikasitet të ulët (numri i pesticideve që analizohen është shumë i kufizuar), si e tillë nuk janë të përshtatshme për analizimin e mbetjeve të pesticideve për qëllime të kontrollit ushqimor në kuadër të sigurisë ushqimore. Prandaj në kёtё studim do tё thellohemi nё zhvillimin dhe vlerësimin e metodave qё kanë për qëllim ti vijnë nё ndihmë sadopak zgjidhjes sё këtij problemi. Vënia në dispozicion të laboratorëve analitik metoda të provuara të analizimit njëkohësisht të një numri të madh pesticidesh paraqet kontribut shumë të rëndësishëm shkencor dhe praktik. Zbatimi i këtyre metodave në hulumtimin dhe vlerësimin e nivelit të mbetjeve të insekticideve në organet bimore, e rrit rëndësinë e studimit, kurse praktikës 15

profesionale do t‟i propozojë informacionin e domosdoshëm mbi kohën e vjeljes së produkteve në përputhje me dozën e trajtuar. Duke u nisur nga sa u tha më lart, për realizimin e këtij qëllimi janë caktuar këto objektiva: 







Vlerësimi në laborator i metodave të analizimit të mbetjeve të pesticideve: metoda Kadenzcky, metoda SweEt dhe metoda QuEChERS. Krahasimi ndërmjet tyre. Studimi i ecurisë së shpërbërjes së insekticidit Acetamiprid në spec, për vlerësimin e momentit të vjeljes së tij dhe rekomandimin e dozës më të përshtatshme për përdorim në përputhje me Intervalin e Paravjeljes (PHI) dhe NML-në e rekomanduar. Studimi i ecurisë së shpërbërjes të insekticidit Imidacloprid në bimën e domates në mjedise të mbrojtura, vlerësimin e momentit të vjeljes së tij, dhe rekomandimin e dozës më të përshtatshme për përdorim në përputhje me PHI dhe NML -në. Studimi i nivelit të mbetjeve të pesticideve në tokën e trajtuar të serrave.

16

KAPITULLI II. BAZAT TEORIKE TË STUDIMIT 2.1 PESTICIDET NË BOTËN MODERNE DHE TENDENCA NË ANALIZIMIN E TYRE Sipas FAO (FAO, 1989) pesticidet janë substanca ose përzierje substancash që përdoren me qëllim parandalimin, shkatërrimin, ose kontrollimin e dëmtuesve ku përfshihen edhe vektorët e sëmundjeve në njerëz dhe kafshë, specie të padëshiruara të bimëve ose kafshët që shkaktojnë dëme ose interferojnë gjatë proceseve të prodhimit, procesimit, ruajtjes ose tregtimit të ushqimeve, produkteve bujqësore, drurit dhe produkteve të tij, ushqimet e kafshëve, ose ato të cilat administrohen tek kafshët për kontrollin e insekteve, merimangave dhe akrepave, ose dëmtuesve të tjerë në brendësi apo në sipërfaqe të trupit. Ky term përfshin kimikatet që përdoren si rregullatorë rritjeje, defoliantë, desikantë, agjentë tharës të frutave, ose agjentë për parandalimin e rënies së parakohshme të frutave, dhe subsanca që aplikohen në të lashtat para ose pas korrjes që të parandalohet dëmtimi gjatë ruajtjes apo transportimit. Termi nuk përfshin kimikate si fertilizuesit, ushqyesit bimor apo shtazor, shtuesit ushqimor dhe medikamentet veterinare. Termi i pesticideve i përcaktuar nga FAO në bashkëpunim me UNEP (WHO/UNEP, 1990)i përshkruan ato si kimikate të cilat janë krijuar për të luftuar sulmet e dëmtuesve të ndryshëm dhe vektorëve në të lashtat bujqësore, kafshët shtëpiake dhe qëniet njerëzore. Përkufizimi i mësipërm nënkupton që pesticidet janë agjentë kimikë toksik (kryesisht komponime organike) që lëshohen në mjedis qëllimisht që të luftojnë dëmtuesit e bimëve dhe vektorët e sëmundjeve.

2.1.1 Faktorët që ndikojnë në sjelljen e pesticideve Katër faktorët të cilët më poshtë: 1. 2. 3. 4.

ndikojnë më shumë në sjelljen e pesticideve janë si Vetitë e pesticideve. Vetitë e tokës. Kondicionimi i tokës. Praktikat vepruese/menaxhuese.

2.1.2 Vetitë e pesticideve Vetitë e pesticideve të cilat ndikojnë në lëvizjen e ujërave nëntokësore përfshijnë tretshmërinë, adsorbimin, paqëndrueshmërinë/avullueshmërinë dhe degradimin e tyre ( Stoytcheva, 2011). Tretshmëria: Kimikatet të cilat treten lehtësisht në ujë janë shumë të tretshme. Ashtu si uji lëviz nëpër tokë, ai mbart me vete edhe kimikatet që janë

17

të tretura në të. Ky proces quhet kullim. Pesticidet me tretshmëri të lartë, për këtë arsye, kanë një tendencë për të kulluar nga toka në ujërat nëntokësore. Adsorbimi: Shumë pesticide nuk kullojnë sepse ata janë adsorbuar ose mbahen fort nga grimcat e tokës. Adsorbimi varet jo vetëm nga vetitë e kimikatit, por edhe nga lloji i tokës dhe sasia e lëndës organike të pranishme në tokë. Avullueshmëria: Kimikatet e paqëndrueshme largohen lehtësisht në atmosferë, njëlloj si avullimi i ujit. Nëse një pesticid është shumë i paqëndrueshëm dhe jo shumë i tretshëm në ujë, ka të ngjarë të largohet në atmosferë, dhe do të jetë më pak i pranishëm në kullim te ujërat nëntokësore. Komponime tepër të paqëndrueshme mund të bëhen ndotës të ujërave nëntokësor në qoftë se janë shumë të tretshme në ujë. Degradimi: Një tjetër veti kimike që ndikon në potencialin e kullimit është shkalla e degradimit të pesticideve në tokë. Pesticidet degradohen, ose shndërrohen në forma të tjera kimike, nga rrezet e diellit, mikroorganizmat e tokës, dhe një shumëllojshmëri vetish kimike dhe fizike. Sa më shumë që komponimi të qëndrojë i pa degraduar aq më shumë ai bëhet pjesë dhe subjekt për kullimin. Shumë hidrokarbure të kloruara janë shumë të qëndrueshme në tokë, por nuk gjenden në ujërat nëntokësore për shkak të tretshmërisë së tyre të ulët dhe adsorbimit të fortë ndaj grimcave të tokës ( Stoytcheva, 2011). Vetitë e tokës: Vetitë e tokës që ndikojnë në lëvizjen e pesticideve përfshijnë cilësinë e tokës, përshkueshmërinë dhe përmbajtjen e lëndëve organike në të. Ndërtimi i tokës: Ndërtimi i tokës përcaktohet nga përmasat relative të rërës, baltës dhe argjilës. Ndërtimi i tokës ndikon në lëvizjen e ujit nëpër tokë dhe për këtë arsye, ndikon edhe në lëvizjen e kimikateve të tretura, të tilla si pesticidet. Tokat me argjilë dhe lëndë organike kanë tendencë të mbajnë ujin dhe kimikatet e tretura në të më gjatë. Këto toka kanë gjithashtu më shumë sipërfaqe në të cilën pesticidet mund të adsorbohen. Sa më pak e ngjeshur të jetë toka aq më e madhe është mundësia e pesticideve për të arritur ujërat nëntokësore. (Waxman, 1998) Përshkueshmëria e tokës: Përshkueshmëria e tokës është një masë se sa shpejt uji mund të kalojë nëpër një tokë të caktuar. Uji lëviz shpejt nëpër tokë me përshkueshmëri të lartë. Ata gjithashtu humbasin kimikatet e tretura në ujin ujë shplarës. Në tokat shumë të depërtueshme, koha dhe metodat e aplikimit të pesticideve duhet të jenë të dizenjuara me kujdes për të minimizuar humbjet gjatë kullimit. Përmbajtja e lëndës organike: Ndikimi i përmbajtjes së lëndës organike në tokë ka të bëjë se sa ujë mund të mbajë një tokë dhe se sa mirë do të jetë në gjendje të adsorbojë pesticidin. Rritja e përmbajtjes organike të tokës, 18

nëpërmjet praktikave të tilla si aplikimi i plehut organik ose lërim, rrit aftësinë e tokës për të mbajtur ujin dhe pesticideve të tretura në zonën rreth rrënjës ku ata do të jenë në dispozicion të bimëve dhe të degradimit eventual të tyre. ( Stoytcheva, 2011)

2.1.3 Kondicionimi i tokës: Kondicionimi i tokës ku do të aplikohet pesticidi mund të ndikojë edhe në lëvizjen e pesticideve. Këto kushte përfshijnë thellësinë e ujërave nëntokësore, kushtet gjeologjike, dhe të klimës. Thellësia e ujërave nëntokësore: Sa më e cekët të jetë thellësia e ujërave nëntokësore aq më pak toka do të veprojë si një filtër. Gjithashtu, do të ketë më pak mundësi për degradimin ose adsorbimin e pesticideve. Prandaj, masa shtesë duhet të merren për të mbrojtur ujrat nëntokësore në zonat ku janë afër me sipërfaqen e tokës. Në rajone të lagështa, ujërat nëntokësore mund të jenë vetëm disa metra nën sipërfaqen e tokës. Nëse sasia e reshjeve është e lartë dhe toka është e depërtueshme, uji që përmban pesticidet e tretura mund t‟i duhet vetëm disa ditë që të bjerë në kontakt me ujërat nëntokësorë. Në rajonet e thatë, ujërat nëntokësore mund të jenë disa qindra metra nën sipërfaqen e tokës, dhe kullimi i pesticideve në ujërat nëntokësore mund të jetë një proces shumë më i ngadalshëm. Kushtet gjeologjike: Përveç thellësisë së ujërave nëntokësore, është e rëndësishme të kontrollohet dhe përshkueshmëria gjeologjike ndërmjet shtresave të tokës dhe ujërave nëntokësore. Materiale shumë të depërtueshme, të tilla si zhavorret, e lejojnë ujin dhe pesticidet e tretura të shpërndahen lirisht në ujërat nëntokësore. Shtresat e agjilës, nga ana tjetër, janë shumë më pak të depërtueshme dhe, në këtë mënyrë, pengojnë lëvizjen e ujit. Cilësia e ujërave nëntokësore është më e ndjeshme në zonat ku përshkueshmëria e shtresave gjeologjike është e shpejtë. Klima: Zonat me shkallë të lartë reshjesh apo ujitjesh mund të ketë sasi të mëdha të ujit që shpërlajnë tokën dhe, për këtë arsye, janë shumë të ndjeshëm për kullimin e pesticideve, veçanërisht në qoftë se tokat janë shumë të depërtueshme.

2.2 VETITË E PËRGJITHSHME FIZIKE TË PESTICIDEVE 2.2.1 Klasifikimi i pesticideve bazuar në përbërjen kimike Klasifikimi kimik i pesticideve është deri më tani klasifikimi më i dobishëm për studiuesit në fushën e pesticideve dhe mjedisit. Kjo është për shkak se është ky lloj klasifikimi jep të dhëna për efikasitetin, vetitë fizike dhe kimike të pesticideve përkatëse, njohja e të cilave është shumë e rëndësishme në mënyrën e aplikimit, masat që duhet të merren gjatë aplikimit dhe normave

19

të aplikimit. Bazuar në klasifikimin kimik, pesticidet klasifikohen në katër grupe kryesore përkatësisht; organoklorure, organofosforike, karbamate dhe piretroide (Buchel, 1983).

2.2.2 Pesha molekulare dhe forma Në disa referenca të tilla si manuale të pesticideve, pesha molekulare dhe forma fizike (pamja dhe aroma) e lëndës aktive jepen zakonisht si të dhëna. Pesha molekulare e një substance është një përmbledhje e të gjitha peshave atomike individuale të të gjitha atomeve nga të cilat përbëhet molekula në fjalë. Pesha molekulare e një pesticidi është një veti e pandarë e tij që e dallojnë një pesticid nga tjetri me përjashtim të pesticideve stereoizomerike të cilët kanë pesha molekulare të barabarta dhe ndryshojnë vetëm në orientimet hapësinore të grupit në qendrën e dhënë kirale. Pesticidet e gazta kanë një peshë molekulare prej rreth 103 g/mol ose më pak. Megjithatë, bëhet shumë e vështirë të parashikohet gjendja dhe forma e kompleksit molekular me peshë molekulare që janë më të mëdha se 500g/mol.

2.2.3 Presioni i avujve (VP) Presioni i avullit të një substance është masë se sa lehtë ajo mund të avullojë dhe të kthehet në avull (gjendja e gaztë). Për pesticidet, sa më lehtë të mund të avullohet pesticidi aq më i favorizuar mund të konsiderohet përdorimi i tij nga njëra anë, por ajo mund të ketë ndikim negativ në anën tjetër. Për shembull, një pesticid me veprim tymosës mund të ketë fuqi të dobishme depërtuese dhe kështu është më e dobishme që të ketë presion të lartë avujsh. Megjithatë, një presion i lartë avujsh mund të shkaktojë drift të avullit dhe ndotje të mjedisit. Pesticidet me presionin e lartë të avullit duhet të trajtohen në mënyrë të tillë që avujt të mos largohen në atmosferë. Një pesticid me presion avujsh të ulët nuk lëvizën në ajër, kështu që ka një potencial më të lartë për t‟u grumbulluar në ujë në qoftë se është i tretëshëm në ujë. Nëse nuk është i tretshëm në ujë, pesticidet mund të grumbullohen në tokë ose biotë. Zakonisht njësia e preferuar e SI për presionin e avujve është milipaskal (Mpa) (Kamrin, 2000).

2.2.4 Tretshmëria Tretshmëria është një matje për të treguar se sa lehtë mund të shpërndahet një substancë e dhënë në një tretës të caktuar. Njësia për tretshmërinë në ujë jepet në ppm (pjesë për milion) e cila është e njëjtë si miligram për litër (mg/L). Kur tretshmëria është shumë e ulët, njësitë jepen në ppb (pjesë për bilion), e cila është e njëjtë si mikrogramë për litër (µg/L). Matjet e tretshmërisë varen nga temperatura, pH, polariteti i substancës, lidhjet hidrogjenore, pesha molekulare dhe metoda përdorur ( Stoytcheva, 2011).

20

Rëndësia në sjelljen në mjedis të pesticidit për shkak të tretshmërisë së pesticideve është se, një pesticid i cili është shumë i tretshëm në ujë do të priret për të mos u grumbulluar në tokë ose biotë pwr shkak të natyrës së fortë polare që ka. Kjo dëshmon se ai do të degradohet nëpërmjet hidrolizës e cila është një reaksion i mundshëm dhe shumë i favorizuar në ujë.

2.2.5 Koeficienti i shpwrndarjes oktanol/ujë - Kow (Log Kow) Koeficienti i ndarjes është raporti (në gjendjen e ekuilibrit) i masës së tretur së substancës midis shtresave të barabarta të n-oktanolit dhe ujit. Kow është një parametër pa njësi i cili ofron një parashikim të dobishëm për vetitë e tjera fizike për shumicën e pesticideve dhe substancave të tjera organike me peshë molekulare më pak se 500. Vlerat e Kow për kimikatet organike mund të jetë mjaft i madh, dhe për këtë arsye ajo është shprehur shpesh si Log Kow (që është logaritmi me bazën 10 i Kow) dhe vlerat shkojnë nga 3 deri 7. Kow konsiderohet si një tregues i mirë i bioakumulimit të pesticideve në organizma dhe në zinxhirët e ushqimit. Ky paramter është gjithashtu një tregues shumë i mirë i mënyrës sistemike të veprimit të pesticideve. Pesticidet me vlera të ulëta Kow (në përgjithësi ≤2) tregojnë translokim të mundshëm sistemik të pesticideve të tilla ose metaboliteve të tyre në sistemin transvaskular të bimëve. Vlerat Kow janë të ndikuara në përgjithësi nga polariteti i pesticideve dhe faktorët e përgjithshëm fizik. Pesticidet polare kanë tendencë të jenë më të tretshëm në ujë dhe kanë vlera të ulëta të Kow. Për faktorë të përgjithshëm fizik, Kow do të rritet kur vetitë fizike të mëposhtme rriten; sipërfaqja molekulare, vëllimi molar, pesha molekulare dhe dendësia (Mallhot dhe Peters, 1988).

2.2.6 Koeficienti adsorbimit të tokës Koc/kd Adsorbimi i pesticideve në tokë dhe në sedimente është një faktor i madh që përcakton destinacionin e pesticideve në mjedis dhe mënyrën e tyre të degradimit. Shumica e pesticideve janë jo polare dhe hidrofobike që nënkupton që ata nuk janë shumë të tretshme në ujë. Pesticidet jo polare priren të lagohen nga uji në drejtim të tokës dhe në llum të cilat përmbajnë lëndë jo polare organike. Kd quhet koeficienti sorbimit dhe ajo mat sasinë e pesticideve të adsorbuara mbi tokë për sasinë e ujit, pa marrë parasysh përmbajtjen organike të tokës. Vlerat për Kd ndryshojnë shumë sepse përmbajtja organike e tokës nuk është marrë parasysh në përllogaritje. Parametri i preferuar për të përcaktuar aftësinë e tokës për të adsorbuar pestcidet është Koc pasi ai e merr në konsideratë përmbajtjen organike të tokës. Koc është raporti (në gjendjen e ekuilibrit) i masës së një substance të adsorbuar në njësi mase të tokës, me masën e substancës së mbetur në tretësirën ujore. Koc është një parametër pa

21

njësi dhe vlera e tij varet nga përmbajtja organike e tokës, polariteti i kimikatit dhe pH i tokës ( Stoytcheva, 2011).

2.2.7 Konstantja e ligjit të Henrit -H` Konstantja e Ligjit të Henrit (KLH) është matja e përqëndrimit të një kimikati në ajër gjatë përqëndrimit të saj në ujë. Ajo shpreh tendencën e një materiali për të avulluar nga tretësira ujore në ajër. Ndonjëherë matet, por më zakonisht llogaritet si raport i presionit të avullit (në paskal) x peshë molekulare/tretshmëri (mg/L).

Ku: P = presioni i avullit M = pesha molekulare T = Temperatura S = tretshmëria Rëndësia mjedisore e konstantes së Ligjit të Henrit është se, një pesticid me një vlerë të lartë do avullojë nga uji në ajër dhe do të shpërndahet mbi një zonë të madhe. Në anën tjetër, një pesticid me një vlerë të ulët tenton të vazhdojë të qëndrojë në ujë dhe mund të adsorbohet në tokë dhe sedimente. Vlera e kësaj konstanteje është gjithashtu një pjesë integrale në llogaritjen e volatilitetit të një kimikati.

2.3 Reaksionet karakteristike të pesticideve 2.3.1 Reaksioni i reduktimit të pesticideve Reduktimi i pesticideve është një reaksion kimik në të cilin substrati (pesticidi) i nënshtrohet një reduktimi. Agjentët reduktues në mjedis janë zakonisht jonet H+. Për shembull, malationi i nënshtrohet një reaksioni reduktimi në mjedis acid ujor i cili ndiqet nga zëvendësimi i një prej grupeve etil me H+ duke rezultuar kështu në formimin e dy molekulave izomerike të malation monoacidit në fund të gjysmë jetës. Megjithatë, malation diacidi mund të jetë produkt nëse lihet që reaksioni të zhvillohet në një kohë të gjatë (Wolfe et al, 1977).

2.3.2 Reaksioni i hidrolizës së pesticideve Hidroliza është reaksion i njw substance me ujin. Ajo varet nga pH në të cilën pesticidet reagojnë me ujin (psh. jonet hidrogjen dhe hidroksid). Hidroliza është një nga reaksionet më të zakonshme që shumica e pesticideve i nënshtrohen në mjedis. Shumica organofosfateve dhe karbamateve kanë treguar se hyjnë lehtësisht në reaksionin e hidrolizës në kushte alkaline. Një

22

pesticid që është shumë i tretshëm në ujë do të priret për të mos u grumbulluar në tokë ose biotë për shkak të natyrës së tij polare të fortë. Kjo dëshmon se ajo do të pakësohet nëpërmjet hidrolizës e cila është një reaksion që është i favorizuar nga uji. Shembulli i mëposhtëm tregon hidrolizën e imidaklopridit në ujë (Zheng & Liu, 1999).

2.3.3 Fotodegradimi i pesticideve Fotodegradimi ose fotoliza është zbwrthimi ose transformimi i pesticideve nga rrezet e diellit që shkaktojnë një këputje të lidhjeve kimike. Molekula organike absorbon fotonet dhe eksitohet duke liruar elektronet e për pasojë duke ndryshuar molekulën. Reaksionet e fotolizës janë të rëndësishme për degradimin e molekulave organike në atmosferën e sipërme, në mjediset e cekëta ujore, mbi gjethe dhe në sipërfaqen e tokave. Piretroidet janë veçanërisht të ndjeshme ndaj reaksioneve të fotolizws. Zbërthimi i përgjithshëm i pesticidit në ajër mund të kërkojë disa hapa të cilat i ilustrojmë më poshtë me foto-dekompozimin e parationit (Linde 1994).

2.3.4 Biodegradimi Biodegradimi është zbwrthimi ose transformimi i pesticideve nga agjentët mikrobial të cilët zakonisht ndodhen në ujë dhe në tokë. Shkalla e degradimit mikrobial varet shumë nga sasia dhe natyra e pesticideve të pranishëm në tokë, popullata mikrobiale në tokë dhe kushtet e tokës që favorizojnë aktivitetin mikrobial, të tilla si temperatura të larta, pH të favorshme, lagështi të mjaftueshme të tokës, ventilim dhe përmbajtje organike të lartë. Mikroorganizmat që marrin pjesë në biodegradim përfshijnë kërpudhat, bakteret dhe mikroorganizma të tjera që përdorin pesticidet si substrate të tyre. Piretroidet, organofosfatet dhe disa karbamate janë shumë më të ndjeshme ndaj biodegradimit. Megjithatë, shumica e organoklorureve dëshmojnë vështirësi për t‟u biodegraduar për shkak të lidhjes së fuqishme C-Cl.

2.4 NEONIKOTINOIDET 2.4.1 Historiku i Neonikotinoideve Historia e neonikotinoideve filloi në fund të viteve 1970, kur kimistët në kompaninë Shell Chemicals hulumtuan nitrometilenin heterociklik si insekticid potencial (Sheets, 2010). Ndërsa në vitin 1991, në treg u paraqit klasa e re e pesticideve neonikotinoide që ishte imidaklopridi (Elbert, et al, 2008), po ashtu një rishikim i shkëlqyer i zbulimit dhe zhvillimit të hershëm të këtyre insekticideve është përpiluar nga Yamamoto dhe Casida (1999) (Sheets, 2010).

23

Vetitë e nikotinës si insekticid, të ekstraktuara nga bima e duhanit Nicotiana tabacum, kanë qenë të njohura për shumë vite. Megjithatë, për shkak të toksicitetit të saj të lartë në gjitarë dhe aktivitetit relativisht të ulët të nikotinës si insekticid nuk është përdorur gjerësisht si një pesticid që nga vitet 1940 (Marrs & Ballantyne, 2004).

2.4.2 Çfarë janë Neonikotinoidet? Insekticidet neonikotionoide janë derivate sintetike të nikotinës, një kompleksi alkaloid i gjetur në gjethet e shumë bimëve përveç duhanit (Gervais, et al., 2004). Neonikotinoidet përfaqësojnë klasën më të përdorur të insekticideve në mbarë botën, që nga sinteza e Piretroideve. Ato përfaqësohen me 17% e të gjitha insekticideve të përpunuara në tregun global, prej të cilave imidaklopridi përfaqëson 41.5% të shitjeve në aspektin global (Sauer, et al., 2014). Termi “neonikotinoid” është përdorur për të dalluar këto kimikate nga nikotinoidet, pasi neonikotinoidet janë shumë efektive si insekticide dhe më pak toksik për specie kurrizore. Insekticidet përfaqësuese janë referuar edhe si "klonikotinilet" për të theksuar rëndësinë e atomit të klorit (Cl) për fuqinë e tyre si insekticid (Sheets, 2010). Këto janë insekticide sistemike të cilat absorbohen dhe transportohen përmes bimës, duke u ofruar mbrojtje bimëve prej insekteve të cilat ushqehen me to. Bimët absorbojnë këto kimikate përmes rrënjëve dhe gjetheve të tyre, pastaj përmes indeve vaskulare bima i transporton këto kimikate në nyje, gjethe, lule, madje edhe në fruta (Hopwood et al., 2012). Këto insekticide kontrollojnë dëmtuesit e ndryshëm të kulturave bimore dhe të bimëve dekorative siç janë: afidet (morrat e bimëve), brumbujt, dëmtuesit strukturorë siç janë termitet, po ashtu edhe dëmtuesit e kafshëve të tilla si pleshtat etj. Një tjetër aspekt që favorizon këtë klasë të insekticideve është shumëllojshmëria e metodave të aplikimit të tyre, siç janë: - ngjyrues të farave, - në formë të granulave në tokë, - në formë të spërkatjeve foliare (përmes gjetheve), - përmes injektimit direkt në trungun e pemëve, si dhe - përmes sistemit të ujitjes (duke vendosur insekticidet në ujin e ujitjes); (Elbert et al., 2008). Shumëllojshmëria e metodave të aplikimit (përveç spërkatjes) ndihmon zvogëlimin e kontaktit të drejtpërdrejt me insektet jo të synuara gjatë trajtimit (Hopwood et al., 2012). Mirëpo edhe pse neonikotinoidet kanë toksicitet akut më të vogël në gjitar dhe në disa kurrizorë të tjerë sesa insekticidet që janë më

24

të vjetra, ato mund të jenë shumë toksike dhe të kenë në shenjës edhe organizmat jo dëmtues sesa kimikatet e vjetra (Hopwood, et al., 2013). Kjo për faktin se këto kimikate janë sistemike dhe absorbohen në indet bimore, për çka edhe insektet që mbështeten në nektar, polen apo edhe burime të tjera të florës kanë predispozita të rritjes së ekspozimit oral (gojor) në mbetjet e neonikotinoideve apo të metabolitëve të tyre. Madje mbetjet janë gjetur në pluhurat e kontaminuar të lëshuara nga pajisjet mbjellëse të farës si dhe në barojat që kanë qenë në rritje brenda ose ngjitur me fushat e trajtuara (Hopwood et al., 2012; dhe Krupke et al., 2012). Këto dhe shumë studime tjera tregojnë se këto kimikate që nga koha kur janë aprovuar e deri me sot nuk kanë dalë në bazë të vlerësimeve të parapara. Edhe pse që nga koha sintetizimit deri në zhvillimin dhe përhapshmërinë e këtyre kimikateve si produkte për mbrojtjen e bimëve është treguar për rëndësinë e kësaj klase të kimikateve për mbrojtjen e kulturave bujqësore kundër insekteve tek drithërat, perimet, çaji, pambuku, si dhe për kontrollin e pleshtave në mace dhe qen (Sauer, et al., 2014). Një tjetër çështje që rrjedh nga veprimi sistemik i neonikotinoideve është se ata mbeten toksik brenda bimës për më gjatë se insekticidet të tjera. Provat tregojnë se insekticidet sistemike mund të mbeten në indet bimore për muaj apo edhe më shumë se një vit. Përveç kësaj, disa neonikotinoide mund të vazhdojnë të qëndrojnë në tokë për periudha të zgjatura kohore (siç shihet në tabelën.1.1) (Hopwood et al., 2012) Tabela 1.1 Gjysmë jetesa e Neonikotinoideve në Tokë (Hopwood et al., 2012).

Neonikotinoidet

Gjysmë-jetesa në Tokë (në metabolizmin aerobik të tokës)

Acetamipridi

1–8 ditë

Klothianidini

148–1,155 ditë

Dinotefurani

138 ditë

Imidaklopridi

40-997 ditë

Thiacloprid

1-27 ditë

Thiamethoxam

25-100 ditë

Shënim: Klotianidina është metabolit primar i Thiamethoxam.

2.4.3 Mekanizmi i veprimit të Neonikotinoideve Neonikotinoidet janë insekticide kimike sintetike që janë të ngjashme në strukturë dhe veprim me nikotinën, të cilat janë të dizenjuara që të veprojnë mbi receptorët nikotinikë për kontrollin e insekteve të dëmshme, dhe në të

25

njëjtën kohë, që të shprehin toksicitet të ulët në speciet kurrizore. Kjo arrihet duke zgjedhur komponimet për zhvillim komercial me theks të veçantë për nëntipe nikotinikë të receptorëve që ndodhen në insekte, aktiviteti i të cilave në sistemin nervor qendror të kurrizorëve reduktohet më tej nga depërtimi i dobët përmes pengesave në mes gjakut dhe trurit (Hopwood et al., 2012 & Sheets, 2010). Këto insekticide paralizojnë insektet duke bllokuar një rrugë të veçantë kimike që transmeton impulset nervore në sistemin nervor qendror të insekteve (Tomizawa & Casida, 2003). Neonikotinoidet janë më efektive në bllokimin e impulseve nervore në insektet dhe kafshët jo vertebrore sesa në shumë kafshë të tjera. Për rrjedhojë, ato janë shumë më pak toksike për disa zogj dhe për shumë gjitarë sesa klasat e vjetra të insekticideve që janë zëvendësuar (Hopwood et al., 2012). Studimet e fundit kanë treguar se pesticidet shkaktojnë toksicitet sipas disa mekanizmave. Studimet ritheksojnë se biotransformimi i pesticideve i gjeneron oksigjen dhe azot reaktiv specieve, dhe këto radikale të lira janë të lidhura me Figura 2.1 Mekanizmi i veprimit të toksicitet të shkaktuar nga këto pesticide neonikotinoidëve që kulmon në zhvillimin e stresit oksidativ (Sauer, et al., 2014). Gjithashtu duhet ritheksuar se rezultatet nga studimet e ekspozimit dietik të mbështetura në metabolizmin e shpejtë, tregojnë më pak dëshmi të toksicitetit, me efekte minimale kumulative madje edhe në doza të larta (Sheets, 2010).

2.4.4 Përfaqësuesit e Neonikotinoideve Ekzistojnë shtatë insekticide neonikotionoide, prej të cilave gjashtë prej tyre përdoren në kulturat bujqësore si produkte për mbrojtjen e bimëve siç janë Imidaklopridi, Klothianidin, Thiamethoxami, Dinotefurani, Acetamipridi, Thiakloprid, ndërsa Nitenpirami përdoret për trajtimin e pleshtave, parazitëve të jashtëm, dhe kafshëve shtëpiake (Hopwood et al., 2012). Këto komponime janë klasifikuar si: 1. N-nitroguanidinet (Imidakloprid, Thiamethoxam, Dinotefuran, dhe Klothianidin) dhe

26

2. 2014).

N-cianoaminidet (Acetamiprid dhe Thiacloprid) (Sauer, et al.,

Që nga zbulimi i imidaklopridit, disa kimikate tw tjera analoge me 6chloro-3-pyridylmethyl janë zhvilluar për përdorim komercial. Të përfshira në grupin klorpiridines përveç imidaklopridit bëjnë pjesë acetamiprid, nitenpirami, dhe thiaklopridi (Sheets, 2010). Zëvendësimi i pjesës kloropyridinyl me grupin klorothiazolyl çoj në zhvillimin e gjeneratës së dytë të insekticideve neonikotinoide (Maienfisch et al., 1999). Ky zëvendësim ka treguar një reduktim të mëtejshëm në testet me receptorë tek gjitarët por nuk ka shfaqur ulje të toksicitetit tek gjitarët apo zvogëlim aktiviteti në receptorët nikotinik tek insektet (Sheets, 2010). Komponimet e këtij grupi (klorothiazolet) që janë zhvilluar për përdorim komercial përfshijnë klothianidin dhe thiamethoxam (Maienfisch et al., 1999), ndërsa përfaqësuesi i parë nga ky grup që është regjistruar ka qenë thiamethoxami (Wiesner & Kayser, 2000). Dinotefuran përfaqësuesi i parë i nënklasës së furanikotiniles të insekticideve neonikotinoideve. Përfaqësuesit e këtij grupi posedojnë (±) pjesë të tetrahydro-3-furylmethyl, duke përdorur acetikolinen si përbërës plumbi në vend të nikotinës. Edhe pse struktura ndryshon, përfaqësuesit e kësaj nënklase të furanicotinil konsiderohen insekticide neonikotinoide pasi ato veprojnë përmes mënyrës së ngjashme të veprimit, duke u lidhur me receptorët e nikotinik acetilkoline (Sheets, 2010). Nga gjashtë neonikotinoidet të përdorura zakonisht në mbrojtjen e bimëve, ajo që ka përdorim më të gjerë padyshim është imidiaklopiridi.

2.5 IMIDAKLOPRIDI Lloji i përdorimit: Insekticid Formula kimike: C9H10ClN5O2 Sinonimi: [1-[(6 – chloro – 3 - pyridinyl ) methyl ] – N – qitro – 2 – imidazolidinimine] Klasa kimike: Chloronicotinyl

2.5.1 Efektet e dëmshme dhe simptomat Afati i shkurtër i ekspozimit: mund të sulmojnë sistemin nervor qëndror duke shkaktuar apatinë, çkordinimin.

27

Inhalimi: shfaqet i mundimshëm për frymëmarrjen. Gëlltitja: mund të shkaktojë konvulsione. Pikat e sulmit: sistemi nervor qëndror, mushkëritë, sistemi i tretjes.

2.5.2 Përshkrimi i Imidaklopridit Imidaklopridi [1-[(6 – chloro – 3 - pyridinyl ) methyl] – N – qitro – 2 – imidazolidinimine] është zbuluar në vitin 1984 nga kimistët në Nihon Bayer Agrochem të cilët ishin duke hulumtuar për të paraqitur grupin 3-piridilmetil në strukturën heterociklike të nitrometilenit. Është përfaqësuesi i parë i insekticideve neonikotionoide që është regjistruar për përdorim dhe mbetet produkti më i rëndësishëm tregtar. U zbulua në vitin 1992 si insekticid i pari i grupit të neonikotinoideve dhe i cili kishte ngjashmëri strukturore me nikotinën dhe një mënyrë të ngjashme të veprimit. Ndërsa u regjistruara për herë të parë për përdorim në SHBA nga ana e EPA-së 1 në vitin 1994, dhe akoma është përfaqësuesi insekticideve neonikotinoideve më i përdoruri (Sheets, 2010; Marrs & Ballantyne, 2004; Gervais, J. A et al., 2004; dhe Hopwood et al., 2012).

2.5.4 Vetitë fizike dhe kimike Imidakloprid është i përbërë nga kristalet pa ngjyrë me një erë të lehtë por karakteristike. Presion avulli 7: 3 x 10-12 mmHg në 20 ºC; Koeficienti i shpwrndarjes Oktanol-Uji (log Kow): 0.57 në 21 ºC; Konstantja e Henrit: 1.7 x 1010 Pa·m3/mol; Pesha molekulare: 255.7 g/mol; Tretshmëria (ujë): 0.61 g/L (610 mg/L) në 20 ºC; Koeficienti i sorbimit në tokë (Koc) 8,9: 156-960, vlerat mesatare 249-336 (Gervais, J. A et al., 2004).

2.5.5 Përdorimi: Imidaklopridi është insekticid i klasës së neonikotinoideve me spektër të gjerë veprimi, i cili ka aktivitet të shkëlqyer sistemik dhe kontakti i cili përdoret në kulturat bujqësore, terrene, bimë zbukuruese, si dhe për kontrollin e termiteve dhe pleshtave. Imidaklopridi është aktiv kundër insekteve me aparat gojor shpues-thithës për shkak të vetive sistemike (translaminare) në bimë (Sheets, 2010).

1

EPA – Agjensia për Mbrojtjen e Mjedisit në SHBA

28

2.5.6 Mënyra e Veprimit: Organizmat e synuar Imidaklopridi është dizenjuar për të qenë efektiv përmes kontaktit apo gëlltitjes. Është insekticid sistemik i cili translokohet shpejt nëpër indet bimore pas aplikimit. Imidaklopridi vepron në disa tipe post sinaptike të receptorëve të nikotin acetikolinës në sistemin nervor. Në insekte, këto receptorë janë vendosur vetëm në sistemin nervor qëndror. Impulset nervore shkarkohen në mënyrë spontane në fillim, pasuar nga dështimi i neuronit për të përhapur ndonjë sinjal. Aktivizimi i qëndrueshëm i receptorëve nga paaftësia e acetilkolinesterases për të thyer pesticidin, shkakton paralizë. Ky proces detyrues është i pakthyeshëm. Organizmat jo të synuar Veprimi i Imidaklopridit është i njëjtë në organizmat e synuar dhe ata jo të synuar insektet e dobishme, duke përfshirë edhe bletët, brumbujt grabitqarë tokësorë, grerëzat etj. Sidoqoftë, imidaklopridi është jo efektiv kundër morrave merimangave dhe nematodeve. Receptorët nikotinik të gjitarëve janë të përbërë nga një numër nëntipesh. Ndryshe nga insektet, këto receptorë janë të pranishëm në sistemin neuromuskular si dhe në sistemin nervor qëndror. Megjithatë, prirja e detyrueshme e imidaklopridit në receptorët e nikotinës në gjitarë është shumë më pak se ajo e receptorëve të insekteve nikotinik. Kjo duket të jetë e vërtetë në grupet e tjera të kurrizorëve duke përfshirë shpendët. Barriera ndërmjet gjak tru tek kurrizorët bllokon qasjen e imidaklopiridit në sistemin nervor qendror, duke zvogëluar toksicitetin. Toksiciteti akut: Oral Imidaklopridi është mesatarisht toksik nëse gëlltitet. LD 50 orale në minjtë ishin vlerësuar të jetë 450 mg/kg për të dy gjinitë në një studim dhe 500 dhe 380 mg/kg në meshkuj dhe femra, përkatësisht në një tjetër studim. (Hopwood, J.; Black,S; Vaughan, M; Lee-Mäder, 2013). Në minj, vlerat LD 50 janë vlerësuar në 130 mg/kg për meshkuj dhe 170 mg/kg për femra (Elbert, et al, 2008). Dermal Imidaklopridi është shumë i ulët në toksicitetin nëpërmjet ekspozimit të lëkurës. LD 50 përmes lëkurës në minj ishte më i madh se 5.000 mg/kg siç ishte parashikuar. Hulumtuesit nuk kanë bërë vëzhgimin e acarimit të syve apo të lëkurës në lepuj. Imidaklopridi nuk konsiderohet i ndjeshëm ndaj lëkurës

29

edhe pse raportet e mbindjeshmërisë së lëkurës në ekspozimin ndaj imidaklopridi janë raportuar në kafshët shoqëruese (Hopwood, et al, 2013). Gëlltitja / Frymëmarja Imidaklopridi është i dukshëm nëse thithet përmes frymëmarrjes. Inhalimi 50 LC është vlerësuar të jetë më i madh se 5323 mg/m3 për pluhur dhe 69 mg/m3 për ekspozim aerosol në minjtë. Imidaklopridi në formë pluhuri është konsideruar si pak toksik por forma aerosol është shumë toksike.

2.6 ACETAMIPRIDI (ACE) Emri i zakonshëm: Acetamiprid Emri IUPAC: (E)-N1-[(6-chloro-3-pyridyl)methyl]-N2-cyano-N1-methyl acetamidine Emri Kimik: (E)-N-[(6-chloro-3-pyridinyl)methyl]-N'-cyano-Nmethylethanimidamide Struktura kimike Formula molekulare: C10 H11ClN4 Masa molekulare: 222.68 g/mol Tipi i pesticidit: Insekticid Familja kimike: Insekticid Neonicotinoid Gjendja fizike: Solide, Pudër Ngjyra: 99.9% pudër e bardhë PAI, e zbehtë. Era: Pa erë. Pika e shkrirjes: 98.9°C Tretshmëria në ujë: 4.25 x 103 mg/L ne 25°C Presioni i avullimit: 1 x 10-8 mm Hg Pjesëza e koeficientit Octanol/Ujë: Kow = 6.27

2.6.1 Përdorimi dhe Aplikimet Aplikimet: Kontrollon insekte të tipit thithës në perimet gjethore, perimet frutore, frutat e citrusit, lakrore, rrush, pambuk dhe bimët zbukuruese dhe me lule. Tipet dhe metodat e aplikimit: Ka aplikime në tokë dhe ajër. Mënyra e veprimit: Insekticid me veprim sistemik dhe translaminar, efektiv në luftimin e disa insekteve, si me aparat gojor shpues – thithës (afidet, aleurodidet, cikadat, tripset), ashtu edhe atyre me aparat gojor brejtës (Lepidopteret dhe Koleopteret). Karakterizohet nga lëvizja e shpejtë translaminare dhe sistemike me drejtim akropetal. Kur bie në tokë, thithet nga rrënjët, lëviz me lëngjet e ksilemës, ngjitet deri në gjethet e reja e krijon në to një koncentrim të mjaftueshëm për veprimin ndaj insekteve. Po ashtu edhe gjatë trajtimit të pjesës vegjetative mbitokësore të bimës, pasi thithet me

30

shpejtësi nga kutikula gjethore, ai lëviz në mënyrë translaminare e sistemike, duke mbrojtur edhe pjesët e reja bimore që lindin pas trajtimit. Është efektiv dhe ekonomik në perime në serra e fushë, për luftimin e afideve dhe krahëbardhës së serrave e tripseve.

2.6.2 Dëmet endokrine Nuk ka evidentime për dëme endokrine të shkaktuara nga ekspozimi ndaj acetamipridit. Përdoret në kontrollin e hemipterëve, veçanërisht afideve, thysanoptera dhe lepidoptera, me anë të aplikimit tokësor e gjethor, në një gamë të gjerë prodhimesh, veçanërisht perime, fruta dhe barishte (çajra). Aplikohet me 75-300 g/ha në perime, 100-700g/ha në dru frutorë (Bayer, 2014). Acetamipridi është përbërje e lëvizshme, që biodegradohet lehtë në shumë toka. Rruga fillestare e degradimit në tokë është metabolizmi aerobik. Acetamipridi është i qëndrueshëm ndaj hidrolizës në temperaturat e mjedisit, dhe fotodegradohet relativisht ngadalë në ujë. Ai metabolizohet relativisht shpejt në sistemet aerobe ujore, por metabolizohet ngadalë në sistemet anaerobe ujore. Acetamipridi konsiderohet mesatarisht shumë i lëvizshëm në shumë toka dhe sedimente ujore; sidoqoftë, sipas studimeve, nuk është permanent në mjedis. Është kontaminues potencial i ujërave nën- dhe mbitokësore. Të dhënat tregojnë se acetamipridi është relativisht jopermanent dhe në sajë të lëvizshmërisë së tij të shpejtë degraduese, e redukton potencialin e tij për të kulluar në ujërat nëntokësore. Rruga primare e degradimit të tij është metabolizmi aerobik i tokës, që është një biodegradim i shpejtë në tokë. Është i qëndrueshëm ndaj hidrolizave në temperaturat e mjedisit, dhe fotodegradon relativisht ngadalë në ujë gjë që e bën atë më permanent në ujë. Acetamipridi ka lëvizshmëri mesatarisht të lartë në shumë toka dhe nuk paraqitet i aftë për t‟u lidhur fortësisht në sedimentet ujore. Potentciali i produkteve të degradimit për të arritur ujërat nëntokësore është dukshëm i lartë pasi janë më permanente se acetamipridi mëmë. Lëvizshmëria dhe permanenca e shumë prej produkteve të degradimit në mjedis mund të çojë në kontaminimin e ujërave nëntokësore. Sidoqoftë, ka tregues që kontaminime të tilla nuk kanë ndikime toksike. Acetamipridi mund të arrijë potencialisht ujërat sipërfaqësorë me anë të rrymave spërkatëse apo rrëshkitjeve mjedisore në disa rrethana të caktuara.

2.6.3 Toksiciteti oral dhe dermal ACE është i dëmshëm nëse merret nga goja, ka toksicitet të ulët akut Toksiciteti afatgjatë dhe karcinogjeniteti i ACE është studiuar në brejtës dhe minj. Në kavie organet të cilat u morën në studim ishin mëlçia tek meshkujt

31

dhe femrat dhe veshkat në meshkuj. Pesha trupore zvogëlohet dhe vihet re histo-patologji në mëlçi dhe veshka (WHO 2011). Toksiciteti riprodhues Toksiciteti riprodhues i ACE është studiuar në minj dy breza.. Në përgjithësi, ACE nuk ka treguar potencial për toksicitetit riprodhues (Othmer, 1996). Neurotoksiciteti ACE është studiuar për sjelljen ndaj neurotoksikimit akut dhe subkronik si dhe efektet neuromorfologjike në minj. Shenjat klinike (dridhje, anomali në ecje dhe posturale, ulje e forcës së kthetrave dhe reduktim i aktivitetit lokomotor) janë vërejtur në të dy gjinitë në dozat më të larta. Këto efekte u shfaqën edhe tek meshkujt që në dozat e ndërmjetme gjatë ditëve të trajtimit. Të gjitha së bashku, efektet neuro-toksike ndodhin përafërsisht në të njëjtin nivel dozimi dhe efektet në mëlçi dhe toksiciteti i përgjithshëm vërehet si në studimet subkronike dhe ato të riprodhimit. Gjithashtu, duket se nuk ka dallim në dozat që shkaktojnë neurotoksikimin akut dhe atë të zgjatur.

2.7 TEKNIKAT KROMATOGRAFIKE Kombinimi i kromatografisë dhe spektrometrisë së masës për identifikimin dhe kuantifikimin e pesticideve dhe shumë lloje të tjera të mbetjeve ka tërhequr shumë interesin në vitet e fundit dhe është duke u bërë në mënyrë progresive ndër metodat kryesore të përdorura në laborator për këtë qëllim. Teknikat kromatografike lejojnë ndarjen dhe kuantifikimin e përbërësve të matricave komplekse dhe për këtë arsye ka shumë aplikime në fushën e ushqimit. Në metodat kromatografike, komponentët e një përzierjeje ndahen duke u shpërndarë midis dy fazave:  një faze të palëvizshme (një fazë e ngurtë ose një lëng me mbështetje inerte të ngurta);  një faze të lëvizshme (gaz ose lëng) e cila rrjedh në atë stacionare. Faza e lëvizshme është shpesh e quajtur edhe eluent. Ndarja është për shkak të prirjes më të madhe ose më të vogël nga ana e komponentëve për të zgjedhur për fazat e lëvizshme dhe të palëvizshme.

2.7.1 Metoda Gaz kromatografike Është metoda që ka përdorimin më të gjerë në krahasim me metodat e tjera kromatografike. Në këtë metodë përbërësit e mostrës, ndahen nga njëri–tjetri si pasojë e proçeseve të shpërndarjes nëpërmjet fazës së palëvizshme (të lëngët ose të ngurtë) që ndodhet në kolonë dhe fazës së lëvizshme të gaztë e cila mbart mostrën në gjëndje të avullt.

32

Pjesët e sistemit gazkromatografik Pjesët kryesore të një sistemi gazkromatografik janë:  Injektori  Kolona dhe furra me termorregullim  Detektori  Blloku i rregullimit pneumatik dhe i kontrollit të prurjeve  Termostatet për injektorin, kolonën dhe dedektorin

Figura 2.2 Paraqitja skematike e GC

Sistemi i injektimit – Injektori Sistemi i injektimit përdoret për të dërguar mostrën në kolonë. Ekziston gjithmonë mundësia e “diskriminimit” të mostrës gjatë injektimit. Ky mund të shkaktohet nga teknika e injektimit ose nga konfiguracioni i pajisjes injektuese. Një sërë problemesh lidhen me përdorimin e mikroshiringës për të bërë injektimin e mostrës në aparat. Përpikëria analitike dhe saktësia varen nga shiringa dhe teknikat që lidhen me përdorimin e saj. Konfiguracioni i injektorit ndikon edhe në “diskrimininmin e mostrës”. Injektimi me ndarje (split) Mekanizmi split shërben për futjen e mostrës në kolonë ku ndan mostrën në dy pjesë jo të barabarta, më e vogla nga të cilat hyn në kolonë dhe parandalon mbingarkesën e kolonës. Injektimi pa ndarje (spitless) Në analizat e gjurmëve është e nevojshme të hyjë sa më shumë mostër në kolonë, me qëllim që të marrim një rezultat me ndjeshmëri sa më të lartë. Kjo realizohet nëpërmjet përdorimit të një mekanizmi i cili quhet splitless. Në regjistrimin splitless, një sasi e madhe e mostrës (0.5 – 6 mikrolitra) injektohet

33

në kolonën kapilare. Mekanizmi splitless, nuk nënkupton një injektim direkt të mostrës në kolonë. Ajo kalon më parë në gjëndje të avullt dhe pastaj transportohet në kolonë. Injektimi direkt Kjo teknikë injektimi përdoret me kolonat e gjëra (0.4 – 0.7 mm) dhe për mostrat që kanë shumë komponentë të tretur. Mostra avullon në grykën e hyrjes dhe pastaj kalon direkt në kolonë. Ky lloj injektimi nuk duhet ngatërruar me injektimin e ftohtë (në kolonë). Karakteristikat e kolonës Në pajisjet e sotme gazkromatografike përdoren kolonat kapilare. Për këto kolona, shkalla e ndarjes dhe koha e nevojshme e analizës është funksion i shtatë parametrave:  Gjatësia e kolonës  Diametri i brendshëm  Lloji i fazës stacionare  Trashësia e filmit të fazës stacionare  Lloji i gazit mbartës (fazës së lëvizshme)  Shpejtësia e gazit mbartës  Temperatura e kolonës Katër pikat e para janë karakteristikat e kolonës kapilare të cilat specifikohen nga prodhuesi i tyre. Në kolonat kapilare, faza e lëngët shpërndahet në një shtresë të hollë në faqet e brendshme të tubit prej silice të shkrirë (fused silica) ose çeliku me diametër të brendshëm 0.25 – 1 mm. Shtresa e lëngut është mjaft e hollë dhe e njëtrajtshme, prandaj ekuilibrat ndërmjet fazës së lëngët dhe asaj të gaztë vendosen shpejt, gjithashtu ndikimi i shtjellave është minimal. Sasia e lëngut në njësinë e gjatësisë së kolonës është e vogël, prandaj përdoren kolona shumë të gjata. Që të mos arrihet ngopja e fazës së lëngut të palëvizshme, në kolonë futet një vëllim shumë i vogël i mostrës, rreth 1 µl.

2.7.2 Metoda e kromatografisë së lëngët HPLC, Kromatografia e lëngët Kromatografia e lëngët është sot ndër metodat me të përdorshme të ndarjeve analitike, për mundësinë që ofrojnë ato për të analizuar mostrat e lëngëta në temperaturën e ambientit si dhe për ndjeshmërinë e lartë dhe saktësinë e tyre. Kromatografia e lëngët me presion të lartë (HPLC) është teknika më e përdorshme në ditët e sotme nëpër laboratorët e ndryshëm

34

analitikë. Procesi kromatografik në kromatografinë e lëngët mund të përcaktohet si teknika e ndarjes që bën transferimin e masës ndërmjet fazës stacionare dhe asaj të lëvizshme. Si fazë e lëvizshme përdoren lëngjet. Analitët fillimisht treten në tretësin përkatës dhe pompohen drejt kolonës nën presion të lartë. Normalisht çdo komponent eluon nga kolona dhe del si një bandë e ngushtë e cila regjistrohet nga detektori si pik. Detektimi i komponentëve të eluuar duhet të jetë selektiv ose universal, e cila varet nga detektori që përdor.Detektorët më të përdorshëm në HPLC janë detektorët e absorbimit në UV të cilët bazohen në matjen e absorbancës të përbërësve të mostrës në dalje nga kolona kromatografike.

Figura 2.3 Paraqitja skematike e HPLC-së.

2.8 VLERËSIMI I METODËS Para se të përdoret një metodë bëhet vlerësimi i saj. Qëllimi i këtij vlerësimi është për të demonstruar që metoda është e përshtatshme për qëllimin e caktuar dhe që rezultatet kanë një pasiguri të pranueshme. Vlerësimi i metodës duhet të sigurojë informacion rreth aftësisë së saj për të dhënë rezultate të përsëritshme dhe të riprodhueshme. Me ripërsëritshmëri kuptojmë afërsinë e përputhjes midis rezultateve të njëpasnjëshme të fituara nga e njëjta metodë me mostër identike dhe kushte të njëjta (i njëjti analist, laborator, në kohë të afërta). Riprodhueshmëria është afërsia e përputhjes midis rezultateve të njëpasnjëshme të fituar në kushte heterogjene (analist të ndryshëm, kohë të ndryshme, metodë dhe laboratorë të ndryshëm). Vlerësimi i metodës duhet të masë gjithashtu influencën e faktorëve instrumental, njerëzor dhe mjedisor në pasigurinë e rezultateve. Karakteristikat e një metode të vlerësuar janë: përpikmëria, saktësia, ndjeshmëria, selektiviteti dhe specificiteti, limiti i detektimit dhe i përcaktimit, ndjeshmëria, zona e matjes dhe zona e përgjigjes lineare, rifitimi (SANCO/12571/2013, 2013).

35

Proçedura e vlerësimit të një metode Vlerësimi i një metode kërkon përcaktimin e limitit të detektimit të metodës, të preçizionit (gabimet e rastit gjatë përdorimit të metodës). Për të bërë këto përcaktime, analizohen të paktën 7 ose 10 porcione në disa përqëndrime në çdo matricë që mund të përdoret. Përdoret një përqëndrim lehtësisht mbi limitin e detektimit të metodës dhe një përqëndrim relativisht i lartë, në mënyrë që të mund të specifikohet kufiri i përqëndrimeve për të cilin metoda është e aplikueshme. Përdorimi i disa përqëndrimeve për të përcaktuar bias-in dhe preçizionin do të nxjerrë në pah lidhjen midis këtyre karakteristikave të metodës dhe përqëndrimit të substancës. Kjo lidhje mund të jetë konstante, lineare apo në trajtë kurbe dhe është një karakteristikë e rëndësishme e metodës që duhet shpjeguar qartë. Përcaktimi i preçizionit dhe bias-it për një përqëndrim të vetëm në një matricë të vetme bëhet duke marrë rezultatet e analizave të një numri eksperimentesh rifitimi, pasi kemi fortifikuar matricën që na intereson me një standard me përqëndrim të njohur. Bëhet diferenca midis përqëndrimit të njohur dhe përqëndrimeve të matura.

2.8.1 Parametrat e performancës së metodës analitike Instrumentale Vlerësimi i metodës është i nevojshëm në një laborator analitik për të siguruar përdorimin e procedurave të besueshme analitike në kushte të përcaktuara. Vlerësimi njihet ndërkombëtarisht si një pjesë thelbësore e sistemit të sigurmit të cilësisë në kiminë analitike. Parametrat kryesore të vlerësimit të metodës janë: a. Selektiviteti dhe specificiteti. Këto janë terma që shpesh ngatërrohen mes tyre. Termi specifike përdoret në një metodë kur kërkohet përgjigje vetëm për një substancë, kurse termi selektiv përdoret kur në një metodë kemi të bëjmë me një numër substancash që analizohen (Boque et.al. 2001). Monografitë amerikane përcaktojnë si selektivitet të metodës analitike aftësinë e saj për të matur me saktësi një substancë në prani të lëndëve të tjera interferuese që mund të jenë të pranishme në një matricë, si psh paraardhës sintetik, shtesa produkti, produkte të degradimit etj. Selektiviteti i metodës analitike përcaktohet duke krahasuar rezultatet e fituara nga mostra me papastërti me ato të fituara nga mostra pa papastërti. Gjykimi i përcaktimit bëhet nga diferenca e rezultateve mes dy tipeve të mostrave. b. Përpikëria. Përpikëria e një metode është shkalla e pranueshmërisë midis rezultateve individuale të provave të përsëritura. Devijimi standart i matur mund të nëndahet në dy kategori: përsëritshmëri dhe riprodhueshmëri. Përsëritshmëria fitohet duke kryer analizat në laborator, nga një analist, duke 36

përdorur të njëjtat pajisje në një kohë të shkurtër. Riprodhueshmëria përcaktohet nga kryerja e një analize në në një laborator, por në kohë të ndryshme. Riprodhueshmëria mund të aplikohet në një metodë nga analistë të ndryshëm, me instrumente të ndryshme. Përpikmëria shprehet si përpikmëri relative brenda ditës ose si përpikmëri relative midis ditëve (Lazo 2008, Çullaj 2005, Watson 1999). c. Saktësia. Saktësia e një metode analitike është shkalla e pranueshmërisë së rezultateve të fituara nga metoda, nga vlera e vërtetë e përmbajtjes së substancës. Vlera e vërtetë për vlerësimin e saktësisë mund të fitohet në dy rrugë: nga krahasimi i rezultateve të metodës me ato të një metode të njohur si referuese ose nga ndarja e substancës që na intereson në përqëndrime të njohura të saj nga matrica ku ajo ndodhet. Pas ekstraktimit të substances nga matrica dhe kryerjes së analizës në instrument, përgjigja e fituar krahasohet me atë të materialit referues në solvent të pastër (Çullaj 2005; Watson 1999). d. Lineariteti. Lineariteti i një metode është aftësia e saj të nxjerrë rezultatet e provës që janë fituar drejtëpërsëdrejti ose nga transformimet matematikore, proporcionale me sasinë e analitit në mostër brenda një shkalle të dhënë. Lineariteti përcaktohet nga një seri matjesh të standarteve në rreth gjashtë përqëndrime të ndryshme që përfshin 50-150 % të shkallës së pritur të punës. Rezultati duhet të jetë i lidhur linearisht me përqëndrimin e standarteve. Një ekuacion i vijës lineare duhet të ketë një ndërprerje me boshtin jo shumë larg vlerës zero. Nëse fitohet një gjë e kundërt, atëherë duhet të demostrohet që kjo nuk ka ndikim në saktësinë e metodës (Çullaj 2005; Watson 1999). e. Zona e punës. Zona e punës e një metode analitike është intervali midis niveleve të sipërm dhe të poshtëm (duke i përfshirë edhe këto) që janë demonstruar në përcaktimin me përpikmëri, saktësi dhe linearitet gjatë përdorimit të kësaj metode. Shkalla është normalisht e shprehur në të njëjtat njësi si edhe rezultatet e provës (p.sh. përqindje, pjesë për million) të fituara nga metoda analitike (Watson 1999). f. Kufiri i diktimit dhe kufiri i përcaktimit (KD dhe KP). Kufiri i dedektimit është përqëndrimi më i ulët i analitit në një mostër, që mund të detektohet por jo domosdoshmërisht në mënyrë sasiore, në kushtet e përcaktuara të analizës. Kufiri i përcaktimit është përqëndrimi më i vogël i analitit në një mostër që mund të përcaktohet me një përpikëri të pranueshme në kushtet e përcaktuara të analizës (Sanagi et.al. 2009, Mc Naught et.al. 1997, Long et.al. 1983). Ka disa metoda të mundshme konceptuale të përcaktimit dhe llogaritjes së KD dhe KP. Tre metodat kryesore rekomandohen në udhëzuesit e ICH -1996 (Konferencës Ndërkombëtare të Harmonizimit) dhe EURACHEM-1998, dhe bazohen në:

37

a. Sinjal –zhurmë: Me anën e kësaj metode matet zhurma pik-më-pik rreth kohës së retensionit të analitit, e si rrjedhim, llogaritet përqëndrimi i analitit që do të prodhonte një sinjal të barabartë me një vlerë të caktuar të raportit zhurmë/sinjal. Zakonisht merret një vlerë S/N e barabartë me 3 për të llogaritur KD, ndërsa vlera S/N e barabartë me 10 përdoret për të llogaritur KP. Kjo metodë përdoret zakonisht në metodat analitike që shfaqin zhurmë në baseline (ICH 1996, Sanagi et.al. 2008). b. Përcaktimi i provës së bardhë: kjo metodë zbatohet kur analizat e provës së bardhë japin një shmangie standarte jo-zero. KD shprehet si përqëndrimi i analitit që i korrespondon vlerës së matur të provës së bardhë shtuar trefishin e shmangies standarte, ndërsa KP është përqëndrimi i që i korrespondon vlerës së matur të proves së bardhë shtuar dhjetë shmangie standarte, siç tregohet në ekuacionin e mëposhtëm: KD ≈ x bi + 3 sbi KP ≈ x bi + 10 sbi Ku x bi është përqëndrimi mesatar i provës së bardhë dhe sbi është shmangia standarte e provës së bardhë (ICH 1996, Sanagi et.al. 2008). c. Regresi linear. Për një kurbë kalibrimi lineare, supozohet se përgjigja e aparatit y ka një varësi lineare nga përqëndrimi i standartit, për një interval të kufizuar përqëndrimesh. Ajo mund të shprehet si: y= a + bx Rifitimi i një analiti në shqyrtim është përgjigjja e detektorit marrë nga shuma e analitit të shtuar dhe ekstraktuar nga matrica, krahasuar me përgjigjen e detektorit për përqendrimin e vërtetë të standardit të pastër. Eksperimentet e rifitimit duhet të kryhen duke krahasuar rezultatet analitike për mostrat e nxjerra në tre përqendrime. Rifitimi i analitit nuk duhet te jete jashte intervalit 70-120 (SANCO/12571/2013, 2013).

38

KAPITULLI III. MATERIALI DHE METODA 3.1 VENDNDODHJA E EKSPERIMENTIT Studimi është realizuar në dy lloje perimesh; domate dhe spec të cilat kultivohen gjerësisht në serra. Eksperimentet janë ngritur në serrën “Hysni Gjergji” Radë, Durrës. Serra e mbjellë me Domate (230 m2) Serra e mbjellë me Spec (350 m2 )

Figura 3.1 Serrat Hysni Gjergji Radë Durrës. (hartë e google)

Foto 3.1 Serrat me spec dhe domate

Analizat laboratorike janë kryer në: - Institutin e Sigurisë Ushqimore dhe Veterinarisë, - Laboratorin e mbrojtjes së bimëve në Durrës dhe, - Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Abruzzo e del Molise "Giuseppe Caporale" (IZSAM), Teramo, Italy

39

3.2 PËRMBAJTJA E PESTICIDEVE NE TOKËN E SERRAVE PARA TRAJTIMIT Përpara mbjelljes, serrat u trajtuan për qëllime të kultivimit nga fermeri me pesticidin Pyrimex 7.5 i cili përmban 7.5% klorpyrifos etil. Doza e trajtimit 10 kg/ha, sipërfaqja e trajtuar 1000 m2.

Foto 3.2 Hysni Gjergji gjatë trajtimit të tokës

Marrja e mostrave të tokës është bërë në mënyrë të rastësishme në çdo 4-6 m në anë të parcelës dhe në qendër. Thellësia e marrjes së mostrës ishte 0-25 cm dhe janë ruajtur në qesë polietileni. Mostrat e marra në të njëjtën parcelë janë bashkuar dhe homogjenizuar duke formuar mostrën laboratorike. Mostrat janë dërguar në laboratorin e mbetjeve të pesticideve pranë Institutit të Sigurisë Ushqimore dhe Veterinarisë dhe janë ekstraktuar menjëherë.

Foto 3.4 Sonda që shërben për të marrë mostra toke

Foto 3.3 Marrja e mostrave të tokës

40

3.2.1 Metoda e analizimit të mbetjeve të pesticideve në tokë (Ref. JAOAC 51, 403, 472(1968), 56, 728(1973)

3.2.1.1 Ekstaktimi dhe pastrimi Peshojmë 10.0 g tokë të thatë, e sitim në sitë 2 mm dhe e përzjejmë në një elermajer 250 mL. Shtojmë solucion NH4Cl 0.2M (10.7 g/L) dhe e lëmë të pushojë për 15min. Shtojmë 100 mL hekzan-aceton (1+1) mbyllim mirë tapën dhe e vendosim në tundës (≥12orë) me veprim rrotullues në 180 rpm. Me kujdes supernatantin, duke shmangur fazën ujore, e kalojmë në një kolonë 2-3 cm me Florisil dhe e mbledhim eluitin në balonë 250 ml. Shplajmë enën dhe tokën me dy porcione 25 mL hekzane-aceton dhe e dekantojmë përmes kolonës. Shplajmë kolonën me 10 mL hekzan-aceton. Të gjithë ekstraktin e mbledhur e koncentrojmë në rotavapor me pompë vakumi (foto 3.5) dhe koncentratin e rimarrim me 1 ml hekzan. E hedhim koncentratin me hekzan në një vial 2ml dhe e injektojmë në GC-MS (Shimadzu 2010).

Foto 3.5 Tundes horizontal

Foto 3.6 Avullues rotativ

Foto 3.7 Momente pune gjatë procesit të pastrimit të ekstraktit në kolonën kromatografike.

41

Figura 3.2 Skema e ekstraktimit për përcaktimin e mbetjeve të pesticideve në tokë.

3.2.1.2 Kushtet Gas kromatografike Kolona: kapilare HP-5, ID: 0.32 mm, gjatësia: 30 m; filmi: 0.25 µm; Gazi mbartës: Helium me rrjedhje 0.9 mL/min.; mënyra e injektimit: Split në 1:75; Volumi i injektimit: 1 µL; Temperatura e injektimit: 260 ºC; Temperatura e furrës: fillestare 200ºC (1 min) rritet me 5ºC/ min, në 280ºC (5 min); Detector – MS: Temperatura e burimit të joneve: 290ºC , temperatura e sipërfaqes: 290ºC, Lloji i detektimit: Scan.

3.3 NGRITJA E EKSPERIMENTIT 3.3.1 Skema e ngritjes së eksperimentit për studimin e zbërthimit të lëndëve aktive acetamiprid në spec dhe imidakloprid në domate në mjedise të mbrojtura Skema është ngritur mbi bazën e tre varianteve, ku: V1 – Varianti i parë kontroll, është lënë i patrajtuar. V2 – Varianti dytë, është trajtuar me PMB me dozën e rekomanduar V3 – Varianti tretë, është trajtuar me PMB me dozën maksimale (2 x dozën e rekomanduar) Për çdo variant janë trajtuar 30 bimë, Ndërmjet varianteve janë lënë zona buferike (10 bimë)

42

Foto 3.8 Syri Tusha gjatë spërkatjes së varianteve eksperimentale.

Foto 3.9 Variantet eksperimentale

Produktet e Mbrojtes së Bimëve (PMB) të përdorura për trajtim janë: - Confidor (Imidacloprid) 200 SL dhe Mospilan (Acetamiprid) 20 SG

Figura 3.3 PMB Mospilan

Figura 3.4 PMB Confidor

3.3.3 Marrja e mostrave Marrja e mostrave për ekzaminim gaz dhe lëng-kromatografik ka një rëndësi të veçantë dhe është një nga hallkat kryesore të analizës, madje shpesh herë ajo është një burim gabimi që do të çojë në një rezultat jo të besueshëm. Mostra është zgjedhur në mënyrë të tillë që të përfaqësojë sa më realisht gjendjen e mjedisit që duam të kontrollojmë. Për të marrë një mostër sa më përfaqësuese, janë marrë sasi të vogla materiali nga të gjitha bimët e përfshira në eksperiment. Këto sasi bashkohen në një mostër kompozite, e cila copëtohet dhe homogjenizohet. Nga kjo mostër përdoret një sasi e caktuar për analizën. Çdo mostër duhet të përfaqësohet nga të paktën 20 bimë për të siguruar material përfaqësues të mjaftueshëm për provat analitike. Pas mbledhjes mostrat do të pastrohen nga dheu dhe nga pjesët e huaja.

43

Foto 3.10 Gjatë marrjes së mostrave

Foto 3.11 Gjatë marrjes së mostrave

3.3.3.1. Frekuenca e marrjes së mostrave Marrja e mostrave ka filluar çdo herë 2 ditë pas trajtimit dhe ka vazhduar çdo dy ditë deri në ditën teorike të paravjeljes (PHI) dhe dy ditë pas ditës teorike të paravjeljes. Tabela 3.1 Frekuenca e marrjes së mostrave: Viti I (2010) II (2011) III (2012)

Muaji Qershor Qershor Maj

Data e trajtimit 16 1 13

Data e marrjes së mostrave 18 3 16

20 6 18

23 8 20

25 11 23

3.3.3.2 Transporti dhe ruajtja e mostrave Çdo mostër, është shoqëruar me dokumenta identifikimi, ku janë të përcaktuar mirë koha dhe vendi i marrjes së mostrës, kushtet e mjedisit ku janë marrë mostrat, si dhe të dhëna të tjera të veçanta që janë përcaktuar në momentin e marrjes së mostrës. Transporti i mostrave është kryer brenda ditës, në kushte të freskëta (me termoboks).

Foto 3.12 Marrja e mostrave (domate)

Foto 3.13 Marrja e mostrave (spec)

44

3.3.3.3 Homogjenizimi i mostrave Shkalla e homogjenitetit kontribuon tek gabimi i rezultatit analitik. Homogjeniteti duhet të jetë i tillë që të mos kontribuojë shumë në krahasimin e hapave analitike. Submostrat që do të analizohen nevojiten të jenë aq të mëdha sa do të jenë të mjaftueshme për të kompensuar inhomogjenitetin. Përmasat e vogla janë avantash në lidhje me konsumin e solventëve, të lehta në manovrim, por duhet të gjendet një optimum.

3.3.3.4 Përgatitja e mostrave për analizë Peshojmë sasinë e këshilluar të mostrave analitike nga materiali i përzier mirë dhe i homogjenizuar. Gjithmonë merret në konsideratë numri i analizave që do të përsëriten dhe provat e rigjenerimit që do të kryen. Etiketojmë secilën enë të mostrës me numrin e laboratorit të mostrës dhe datën e përgatitjes së mostrës. Fillojmë ekstraktimin dhe fortifikimin e mostrave analitike menjëherë pasi përgatitet mostra nëse është e mundur, përndryshe e vendosim në ngrirje të thellë.

3.3.3.5 Përgatitja e mostrave të ngrira për analizë Heqim mostrën nga ngrirja e thellë dhe e lemë atë të shkrijë tërësisht në mostrën e mbyllur. Më pas veprojmë sikur mostra të ishte e freskët.

3.3.3.6 Përgatitja e mostrave miratuese Përveç mostrave analitike do të përgatiten edhe mostrat miratuese në përputhje me metodën e përdorur për përgatitjen e mostrave analitike. Këto mostra miratuese do të mbahen në ngrirje të thellë derisa të përfundojë analiza.

3.3.3.7 Ruajtja e mostrave Mostrat e serrave do të ruhen 3 muaj. Submostrat e përgatitura për konfirmim do të mbahen në ngrirje të thellë derisa analiza të kryhet komplet. Mostrat e mbikqyrjes së eksperimenteve do të mbahen derisa të vlerësohet raporti përveç periudhës specifike të përshkruar në planin e studimit.

3.3.4 Ekstraktimi dhe veçimi Për arritjen e qëllimit të punës sonë për marrjen e mbetjes së pesticidit nga materiali bimor, përdoret një tretës ose një grup tretësash. Gjatë procesit të ekstraktimit përdorim tretës apo përzierje tretësash të cilët bëjnë të mundur ekstraktimin sa më specifik të analitit, duke ekstraktuar sa më pak nga përbërësit e tjerë të mostrës, si yndyrnat, ngjyruesit, etj. (DFG, 1992). Tretësit më të përdorur janë: acetonitrili, acetoni, acetati i etilit. Acetoni si tretës ekstraktues ka përparësi ndaj acetonitrilit, pasi avullon më shpejt, pra është më 45

i lehtë për t‟u koncentruar dhe eleminuar, ai është më i lirë dhe relativisht jo toksik, por disavantazhi i tij është se ai nuk është shumë selektues (Ardrey, 2003). Në manualin Gjerman (DFG, 1992) thuhet se etilacetati ka më shumë diapazon ekstraktues, nga pesticidet jo polare deri tek ato më pak polare. Një tjetër përparësi është fakti se etilacetati dhe acetonitrili japin ekstrakte më të pastra se acetoni, kjo do të thotë që ato janë më selektivë. Për të analizuar një numër të madh të mostrave, historia e trajtimit me pesticide të të cilave, është zakonisht e panjohur, laboratori duhet të përdorë metoda analitike të afta për të përcaktuar në të njëjtën kohë mbetje të shumta të pesticideve. Këto metoda të shumë-mbetjeve (MRM) mund të përcaktojnë shumicën e pesticideve. Metoda më e zakonshme MRM mund të zbulojë gjithashtu edhe shumë metabolitë, papastërtitë dhe produkte të ndryshimit të pesticideve (Di Muccio, 2006). Metodat selektive të mbetjeve (SRM) janë përdorur gjithashtu për të përcaktuar pesticide të vecanta. Një SRM përcakton një pesticid ose një numër të vogël të përzgjedhur të pesticideve dhe/ose mbetje të lidhura kimikisht. Një dyshim për një shkelje ose një nevojë për të marrë të dhëna të mbetjeve të përzgjidhura në produkte të veçanta, zakonisht shkakton nevojën e përdorimit të këtyre metodave ( Di Muccio, 2006) Kufiri më i ulët i matjes së mbetjeve të një pesticidi është zakonisht shumë më poshtë niveleve të tolerancës. Nivelet e tolerancës përgjithësisht variojnë nga 0,01-5 pjesë për milion (ppm). Mbetjet e pranishme në 0,01 ppm dhe më lart janë të matshme, megjithatë, për pesticide individuale, ky rang mund të shkojë 0,005-1 ppm. (SANCO/12571/2013, 2013)

3.4. METODA E EKSTRAKTIMIT KADENCZKY 3.4.1. Parimi i metodës: Mostra homogjenizohet në prani të një adsorbenti, në mënyrë që të shkatërrohen muret qelizore të saj, përzierja hidhet në një kolonë kromatografike dhe eluohet me një tretës të përshtatshëm (Kadenczki et al, 1992).

3.4.1.1 Përgatitja e mostrës për analizë Përzgjedhja e madhësisë së mostrës laboratorike dhe procedurave për zvogëlimin e madhësisë së mostrës, është bazuar në rekomandimet Codex Alimentarius ose në Direktivat e Komunitetit Europian. Nga mostra fushore është përgatitur një porcion i mostrës laboratorike dhe më pas porcioni i mostrës së provës (ose testimit). Mostra fushore u zgjodh që të përmbante jo më pak se 1kg dhe jo më pak se 5 njësi nga komoditeti i zgjedhur. Mostra laboratorike u përgatit duke prerë frutat në katër pjesë dhe duke marrë ¼ e

46

secilit frut. Për shkak të shpërndarjes jo të njëllojtë të mbetjeve në bimë, për të arritur homogjenitet, u bë copëtimi, me qëllim që të merrej një mostër sa më përfaqësuese dhe u homogjenizua në një përzierës (blender). U homogjenizua afërsisht 1kg mostër.

Foto 3.14 Përgatitje e mostrës për analize Foto 3.15 Homogjenizimi i mostrës 1

3.4.2 Përpunimi i mostrave Pas procesit të grirjes, peshohet në peshoren analitike (me ndjeshmëri 0.01g) afërsisht 5 gramë mostër dhe shënohet masa e mostrës. Mostra e peshuar vendoset me kujdes në një havan porcelani. Peshohet 10g florisil, i cili shtohet në havan së bashku me mostrën. Me ndihmën e shtypësit përzihen mirë deri në formimin e një masë homogjene, me qëllim që të sigurohet një lëvizshmëri e mirë e mostrës gjatë përgatitjes në kolonën kromatografike.

3.4.3.1 Përgatitja e kolonës Kolona e qelqit e gjatë 40 cm, e me diameter të brendshëm 22 mm u vendos në një mbajtëse metalike. Në fundin e saj u vendos lesh xhami dhe pas tij një shtresë prej 5 cm sulfat natriumi anhidër. Hidhet me kujdes me anë të një hinke mostra e përgatitur në havanin e porcelanit. Kolona u paketua në mënyrë të tillë që ndërmjet masës së mostrës dhe adsorbentit të mos kishte hapësira boshe.

Foto 3.16 Ekstraktimi në kolonë

Foto 3.17 Përqëndrimi i mostrës në rotavapor

47

3.4.4.1 Ekstraktimi i mostrës Shplamë havanin me shtypësin me rreth 20 mL solvent ekstraktues etil acetat dhe aceton. U eluua kolona edhe me 30 mL të tjera tretësirë ekstraktuese, me prurje 5 ml/min. Përfundoi ekstraktimi me shtresat e solventit duke u mbledhur gjithsej 50 ml tretësirë ekstraktuese. U mblodh i gjithë ekstrakti në balonin zemër dhe u vendos në rotavapor, ku u koncentrua deri në tharje. Mbetja u rikuperua me 1 mL n-hekzan në rastin e Acetamipridit dhe me 1 mL acetonitril në rastin e Imidaclopridit dhe u injektuan përkatësisht në GC dhe HPLC.

5 g mostër + 10 g florisil homogjenizohen në havan porcelani Mbushja e kolonës kromatografike Lesh xhami + 10g Na2SO4 Eluim me 50 ml etilacetat+ aceton ( 1:5)

Koncentrim i ekstraktit në rotavapor me vakum

Analizim në GC/LC Figura 3.5 Skema analitike për metodën Kadenczky.

3.4.5 Sistemi gaz kromatografik (për acetamipridin) Gaz kromatograf me temperaturë të programueshme, i pajisur me detektor me kapje elektronesh (ECD) Kolona kapilare prej silice të shkrirë, DB-5, me diametër të brendshëm 0.32 mm, gjatësi 30 m, trashësi të filmit 0.25µm. Prurja e gazit bartës helium: 1mL/min. Programi i temperaturës së furrës: 170° C për 1 min, rritje me 10ºC/min deri në 280ºC, ku mbahet 15 min. Temperatura e injektorit: 260 ºC, Foto 3.16 GC-ECD/FID Shimadzu 2010. Temperatura e detektorit: 300 ºC. Gaz make-up për ECD: azot me 30 mL/min.

48

3.4.6 Sistemi lëng kromatografik (për imidaclopridin) Temperatura e kolonës : 25°C, Faza e lëvizshme A : 10 mM format amoniumi pH=4.Faza e lëvizshme B: metanol. Vëllimi i injeksionit: 2 μL Koha (min) 0 11 13 13.1 16

Shkalla e A(%) rrjedhjes µl/min) 450 95 450 5 450 5 450 95 450 95

B (%) 5 95 95 5 5

Foto 3.17 HPLC/UV Shimadzu

Tabela 3.2 Shkalla e rrjedhjes dhe gradienti i eluimit

3.5 METODA E EKSTRAKTIMIT ME ETIL ACETAT (SweEt) Që në 1989, Autoriteti Kombëtar i Ushqimit në Suedi gjithashtu edhe laborator reference EU për mbetjet e pesticideve, përdori një metodë multiresidue që bazohet në ekstraktimin me acetat etili pasuar nga analizimi me LC dhe GC. Metoda është rishikuar vazhdimisht duke sjellë një metodologji të përmirësuar dhe të thjeshtëzuar për analizën e mbetjeve të pesticideve (Pilhstrom et al, 2009).

3.5.1 Hapësirat e aplikimit-matricat Metoda është përdorur për analizën e mbetjeve të pesticideve në fruta dhe zarzavate me anë të detektimit HPLC dhe GC/ECD dhe është bërë e vlefshme në përputhje me SANCO 10684-2009 për tre grupe artikujsh 1) përmbajtje e lartë uji 2) përmbajtje e lartë acidi dhe përmbajtje e lartë uji 3) përmbajtje e lartë sheqeri dhe e ulët uji.

3.5.2 Parimi i metodës Mbetjet ekstraktohen nga matriksi ushqimor me acetat etili. U shtohet hidrogjen karbonat natriumi për të homogjenizuar sa më mirë mostrën që u ekstraktua me etil acetat. Pas centrifugimit dhe filtrimit u injektua në GC dhe LC.

3.5.3. Reagentet dhe kimikatet  Etil acetat  Sulfat Natriumi anhider  Hidrogjen karbonat Natriumi anhidër

49

3.5.4. Mjetet         

Pajisje përpunimi të mostrave, Pipeta standarde automatike me vëllim prej 10 μL, 100-1000 μL Tuba centrifugimi 50 mL me tapë, Cilindër vëllimetrik 25 mL për acetat etili Shiringa, psh. shiringa 10 mL Filtra shiringe, me madhësi poresh 0.20 μm Vialë injektimi 1,5mL të përshtatshme për LC dhe GC auto-sampler Centrifugë Banjë ultrasonike

3.5.5 Ekstraktimi 1) Pesho 3.0 g hidrogjen karbonati natriumi (NaHCO3) në 10 ±0.1g mostër në një tub centrifuge 50 mL. 2) Shto 10 g sulfat natriumi (Na2SO4) dhe 20±0.1 mL acetat etili dhe ekstrakto duke tundur (30 sek) dhe ultrasonikuar (3 min), max 35°C 3) Centrifugo 3 min në 3800 rrot/min. 4) Filtro ekstratin krudo përmes një filtri PTFE 0.20 μm 5) Injekto në GC dhe LC

Figura 3.6 Skema analitike për metodën me etil acetat

50

3.6 METODA QUECHERS (UNI EN 15662:2009) 3.6.1 Fusha e përdorimit Procedura e paraqitur përdoret për përcaktimin e mbetjeve të pesticideve në produktet ushqimore me origjinë bimore, përmes gas kromatografisë me dedektim në spektrometrinë e masës (GC-MS) dhe kromatografisë së lëngët me dedektim në spektrometrinë e masës (LC-MS/MS). Fusha e matjes së metodës, në lidhje me matricën dhe me përbërësin aktiv të marrë në konsideratë, është në intervalin nga 0,010-0,10 mg/kg (nivel minimal) në 1,00 mg/kg (nivel maksimal). Për përqëndrime më të larta të pesticideve testuese, duhet të bëhet një zgjerim i lakores së kalibrimit ose një hollim i tretësirës së kampionit, në mënyrë që sinjali i tretësirës së kampionit të jetë i marrë në intervalin e verifikuar të tarimit.

3.6.2 Parimi i metodës Kampioni në analizë homogjenizohet dhe ekstraktohet me anë të acetonitrilit. Kampionet që përmbajnë një sasi uji <80% kërkojnë shtimin e një sasie uji para ekstraktimit fillestar. Pas shtimit të sulfatit të magnezit, klorurit natriumi dhe kripërave buferike të citratit (pH 5-5.5), përzierja tundet fort dhe centrifugohet për të arritur ndarjen e fazave. Një alikuotë ekstrakti pastrohet përmes ekstraktimit me fazë solide disperguese (SPE) përmes një rezine me përmbajtje aminash primare dhe sekondare dhe sulfat magnezi për të hequr ujin e mbetur. Tretësira e marrë analizohet përmes gaz kromatografisë me detektor të ndarjes së masës (GCMS/MS) dhe kromatografisë së lëngët në spektrometrinë e masës (LCMS/MS).

3.6.3 Reagentët Acetonitril, i përshtatshëm për analizën e pesticideve Acid acetik (CH3COOH) glacial Acid formik (HCOOH) 99 %, p/p. Ujë me shkallë të lartë pastërtie (ultrapure) Formiat amoni Metanol për HPLC Kripëra për përgatitjen dhe pastrimin e kampionit Disodium hidrogenocitrat sesquihidrat Sulfat magnezi anhidër Klorur natriumi

51

Trisodium citrat dihidrat (C6H5Na3O7 · 2H2O ) Toluen i përshtatshëm për analizën e pesticideve Kripërat e përdorura për përgatitjen e ekstraktit të kampionit mund të blihen me parapaketim. Kampionet e kontrollit Kampionet negative për të përdorur në test si “provë e bardhë”, për përgatitjen e kampionit me standard të shtuar dhe për përgatitjen e provës së bardhë për lakoren e kalibrimit në matricë. Përmes analizave të mëparshme është përcaktuar mungesa e analitëve që do të testohen në kampione të tilla. Standardet e referimit Standard i pesticideve të certifikuara (Dr. Ehrenstorfer, Riedel de Haen ose ekuivalente). Standard i brendshëm Trifenilfosfat (TPP) i certifikuar (Dr. Ehrenstorfer ose ekuivalente).

3.6.4 Materialet/ Pajisjet Materialet Kolonë kapilare DB 5MS 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm, ose ekuivalente. Kolonë HPLC Phenomenex Synergi 4u Hydro - RP, 150 x 2,0 mm, 4 m ose ekuivalente. Flakona qelqi të errët afërsisht 20 ml, të pajisur me tapë vidhosëse me guarnicion prej tefloni. Mikrovialë me tapë vidhosëse 1,5 ml për GC. Mikrovialë me tapë vidhosëse 1,5 ml për LC. Pipeta 10-100 µl. Pipetë me vëllim bazë të disponueshëm 100-1000 µl. Tuba me një përdorim 15 e 50 ml të tipit Falcon, ose ekuivalente. Shiringa për gas-kromatografinë 5 ose 10 l. Pajisjet Peshore teknike me saktësi të paktën 0,01 g. Peshore analitike me saktësi 0,0001 g. Centrifugë. Përzierës Vorteks Homogjenizues grirës me ndryshues shpejtësie. Sistem avullimi me ngrohje, me rrymë azoti . Sistem GC-MS dhe LC-MS/MS të lidhur me kompjuterin për përdorimin, përvetësimin dhe përpunimin e të dhënave (ose sisteme ekuivalente).

52

3.6.5 Mënyra e veprimit 3.6.5.1 Përgatitja e tretësirës standarde Tretësirat standarde mëmë (rreth 2000 ppm) të pesticideve specifike në tabelat 2, 3, 4 dhe të standardit të brendshem (SB): për shkak të heterogjenitetit të strukturës së përbërësve aktiv të disponueshëm në treg dhe të tretshmërive të tyre të ndryshme në tretësat organik nuk është e mundur të uniformizohet preparati i tretësirave standarde mëmë. Në lidhje me sasinë, formën dhe tretshmërinë e analitit, vazhdohet me përgatitjen e tretësirave standarde me përqëndrimin rreth 2000 ppm (duke patur parasysh pastërtinë e certifikuar), duke peshuar përbërsit aktiv 10, 20, 40, 50 e 100 mg në balona të taruar, përkatësisht 5, 10, 20, 25 e 50 ml. Treten dhe hollohen deri në shenjën e tarimit me tretësat e treguar në certifikatën shoqëruese. Tretësirat standarde mëmë (rreth 1000 ppm): për analitët pak të tretshëm në tretësit organikë, përgatiten tretësira mëmë me përqëndrim rreth 1000 ppm (duke patur parasysh pastërtinë e certifikuar), duke peshuar përbërsit aktiv të 10, 20, 40, 50 e 100 mg në balonat e taruar, përkatësisht 5, 10, 20, 25, 50 dhe 100 ml. Treten dhe hollohen deri në shenjën e tarimit me tretësa të treguar në certifikatën shoqëruese. Koha e vlefshmërisë së tretësirës mëmë është 1 vit, megjithatë ajo nuk mund të kalojë datën e skadencës së përbërjes së pastër të shënuar nga prodhuesi. Koha e vlefshmërisë së tretësirës mëmë mund të jetë përtej 1 viti në bazë të rezultateve të testeve të stabilitetit të kryera në laborator. Përzierjet standarde të punës (50 ppm): përgatitet përzierja standarde e punës duke i grupuar analitët e testit në varësi të tretshmërisë dhe stabilitetit. Kalohet në balon 10, 20, 25 ose 50 ml një vëllim i tretësirave standarde mëmë specifike i tillë që të përftohet përqëndrimi përfundimtar prej 50 ppm, pasi të hollohet dhe të çohet deri në shenjën e tarimit me tretësira 0.1% (v/v) acid acetik glacial në acetonitril. Data e skadencës së secilës përzierje standarde pune përkon me datën e skadencës më të afërt të tretësirës standarde mëmë të përdorur për përgatitjen e saj. Më në fund, përgatitet një tretësirë trifenilfosfat (TPP) me përqëndrim pune 20 ppm: hollohet me acetonitril një vëllim të tretësirës mëmë e tillë që të merret një përqëndrim përfundimtar prej 20 ppm ( tretësirë SB).

3.6.5.2 Përgatitja e kampioneve Secila tipologji e matricave trajtohet duke larguar komponentët që mund të pengojnë homogjenizimin (psh arra, farëra etj), duke marrë parasysh faktin që,

53

në termin e procesit analitik, niveli përfundimtar i mbetjeve të pesticidit të përcaktuar duhet të shprehet në lidhje me produktin origjinal. Homogjenizimi i kampionit duhet të kryhet në temperaturë të ulët, për të rritur homogjenitetin e kampionit, që të reduktohen përmasat e pjesëzave të vetë kampionit (duke favorizuar procesin e ekstraktimit të mbetjeve) dhe për të evituar degradimin e mbetjeve të veçanta të ndikuara nga rritja e temperaturës. Tipologjitë e ndryshme të matricave paraqiten në tabelën 1.

3.6.5.3 Matricat me përmbajtje të lartë uji dhe matricat me përmbajtje të lartë uji dhe acidi Mostra e marrë në laborator copëtohet me një thikë dhe lihet në frigorifer për disa orë para homogjenizimit me një homogjenizator. Kjo lejon që të merret një mostër me cilësi dhe temperaturë të përshtatshme për të siguruar një homogjenizim të mirë. Nëse kampioni nuk është në gjëndje të ngrirë (për shembull perime me lëngje konservuese) ose në rastin në të cilin nuk mund të presim ngrirjen e njëjtë, përdoret akull i thatë (rreth 50 g akull të thatë për 500 g matricë) duke homogjenizuar me homogjenizator për disa minuta. Nëse nuk analizohen menjëherë, të ruhet mostra e homogjenizuar në frigorifer për një periudhë maksimale prej gjashtë muajsh.

3.6.6 Ekstraktimi i kampioneve 3.6.6.1 Përgatitja e kampionit të bardhë Peshojmë saktësisht 10,00 ± 0,10 g mostër negative të kontrollit në një tub centrifuge 50 mL. Shtohen 10 ml acetonitril dhe 100 μL tretësirë 20 ppm e TPP dhe tundet epruveta e mbyllur me kapak vidë me anë të një mikseri vorteks me shpejtësi maksimale, për 1 minutë. Shtohet një përzierje prej 4.0 g ± 0.2g sulfat magnezi anhidër, 1.00 g ± 0.05 g klorur natriumi, 1.00 g ± 0.05 g trisodium citrat dihidratit dhe 0.50 g ± 0,03 g disodium hidrogjencitrat seskuihidrat dhe tunden me mikser vorteks ose me dorë për 1 minutë. Centrifugohet ekstrakti në 3500 rpm për 5 minuta. Vazhdohet procedura siç përshkruhet në paragrafin 3.6.7.

3.6.6.2 Përgatitja e kampionit Peshohen saktësisht 10,00 ± 0,10 g të mostrës provë në tub centrifuge Falkon 50 ml. Shtohen 10 ml acetonitril dhe 100 μL tretësirë e 20 ppm e TPP dhe tundet në provëz të mbyllur me kapak vidë me anë të mikserit vorteks me shpejtësi maksimale, për 1 minutë. Shtohet një përzierje prej 4.0 g ± 0.2 g sulfat magnezi anhidër, 1.00g ± 0.05 g klorur natriumi, 1.00 g ± 0.05 g trisodium citrat dihidrat dhe 0.50g ± 0,03g disodium hidrogjenocitrat seskuihidrat dhe tunden me mikser vorteks ose me dorë për 1 minutë.

54

Centrifugohet ekstrakti në 3500 rpm për 5 minuta. Vazhdohet me procedurën siç përshkruhet në paragrafin 3.6.7.

3.6.6.3 Përgatitja e kampionit me standard të shtuar Në çdo seri analitike, ekzaminohet një kampion i kontrollit pozitiv, me përqëndrim 100 µg/kg. Peshohet saktësisht 10,00  0,10g kampion i kontrollit negativ (kampion i bardhë) në tub centrifuge Falcon 50mL, shtohen 20L të secilës përzierje standarde të punës në 50 ppm dhe tundet me mikser vorteks ose me dorë për 30 sekonda. Lihet në qetësi për 1 minutë. Shtohen 10 mL acetonitril dhe 100L tretësirë në 20 ppm TPP dhe tundet provëza e mbyllur me kapak vidë, përmes mikserit vorteks me shpejtësi maksimale, për 1 minutë. Shtohet një përzierje 4,0 g  0,2 g sulfat magnezi anhidër, 1,00g  0,05 g klorur natriumi 1,00 g  0,05 g trisodium citrat dihidrat dhe 0,50 g  0,03 g di disodium hidrogenocitrat seskuihidrat dhe përzihet me mikser vorteks ose me dorë për 1 minutë. Centrifugohet ekstrakti në 3500 rpm për 5 minuta. Vazhdohet me procedurën siç përshkruhet në paragrafin 3.6.4.

3.6.7 Pastrimi i kampionëve Kalohet 6 ml ekstrakt (supernatant acetonitril) në tub centrifuge 15 mL me përmbajtje 150 mg PSA e 900 mg sulfat magnezi anhidër. Nga ana operative, kalohen 8 mL ekstrakt (paragrafi 3.6.3) në një tub centrifuge 15 mL dhe ruhet për një natë në konxhelator (për drithërat është e mjaftueshme 2 orë). Pjesa më e madhe e ko-ekstrakteve ngurtësohet dhe eleminohet përmes centrifugimit në 3500 rpm për 1 minutë ose filtrim mbi filtra PVDF 0,45 m. Përzihet me mikser vorteks në shpejtësi maksimale ose me dorë për 30 sekonda. Ekstrakti centrifugohet në 3500 rpm për 5 minuta, me qëllim që të ndahet surpernatanti nga PSA -ja. Supernatanti zhvendoset duke u kaluar në një viale 20 mL. Shtohen 10 L tretësirë acid formik 5 % (v/v) në acetonitril për çdo mL ekstrakt. Për analizat GC-MS, kalohen 800 µL ekstrakt në vialë 2 mL, përqëndrohen në volume të vogla (rreth 20 µl) në rrymë azoti në temperaturë mjedisi dhe merren me 200 µL toluen i acidifikuar me acid formik 0,05% (v/v). Nëse është e nevojshme, të filtrohet mbi një filtër PVDF 0,45 m. Për analizat LC-MS/MS, kalohet 0,5 mL ekstrakt në vialë 2 mL dhe hollohet me 0,5 mL tretësirë ujore acid formik 0,1% (v/v). Nëse është e nevojshme, filtrohet në filtër PVDF 0,45 m.

55

3.6.8 Përgatitja e lakoreve standarde (të zakonshme) në matrica Për të marrë një sasi të mjaftueshme ekstrakti për ndërtimin e lakores së kalibrimit të sistemeve GC-MS dhe LC-MS/MS, ekstraktohen të paktën 4 kampione të bardhë pa shtuar standardin e brendshëm. Pasi të mblidhet një sasi e njohur ekstrakti, pastrohet në Falcon 15 mL, duke patur kujdes që të lidhet sasia e PSA dhe e sulfatit të magnezit anhidër me volumin e ekstraktit të mbledhur. Pasi të jetë përzierë për 30 sekonda në mikserin vorteks ose me dorë, centrifugohet në 3500 rpm për 5 minuta. Mblidhet një sasi e njohur e surpernatantit të pastruar dhe ndahet në dy alikuota, duke i vendosur në dy viale 20 mL.

3.6.8.1 Lakorja e kalibrimit në matricë për analizat GC-MS Njërës nga dy alikuotat i shtohet standardi me qëllim që të merret një përqëndrim i vlerës 200 ppb në kampion (10 µL tretësirë TPP 20 ppm për cdo ml ekstrakt, në rastin e kampionit të peshës 10 g, dhe 5 µL tretësirë TPP në 20 ppm për cdo mL ekstrakt, në rastin e kampionit me peshë 5 g). Duke përdorur këto tretësira për ndërtimin e lakores së kalibrimit hollohet në mënyrë progresive përzierja standarde në 50 ppm, në mënyrë që të përftohen tretësirat e treguara në tabelën 3.5. Merren 800 µL prej secilës tretësirë standarde të përftuar më lart, përqëndrohen në volume të vogla (rreth 20 µL) në rrymë azoti dhe temperaturë mjedisi dhe rikuperohen me 200 µL toluen i acidifikuar me acid formik 0,05% (v/v). Nëse është e nevojshme, filtrohet në filtër PVDF 0,45 m.

3.6.8.2 Lakorja e kalibrimit në matrica për analizat LC-MS/MS Shtohet në alikuotën e dytë të ekstraktit të pastruar, standardi i brendshëm që të merret një përqëndrim i vlerës 200 ppb në kampion (10 µL tretësirë TPP në 20 ppm për cdo ml ekstrakt, në rastin e kampionit me peshë 10 g, dhe 5 µL tretësirë TPP në 20 ppm për cdo ml ekstrakt në rastin e kampionit me peshë 5 g). Kjo tretësirë përdoret për ndërtimin e lakores së kalibrimit në matricë duke e holluar në mënyrë progresive në 50 ppm në mënyrë që të merren tretësirat e paraqitura në tabelën 3.6.

3.6.9 Përgatitja e lakoreve standarde (të zakonshme) në solventë Në rast mungese të një kampioni të kontrollit negativ, lakorja e kalibrimit në solvent ndërtohet duke shtuar standardin e brendshëm në 20 ml acetonitril, për të marrë një përqëndrim të vlerës 200 ppb në kampion (10 µL tretësirë TPP 20 ppm për cdo mL solvent, në rastin e kampioneve me peshë 10 g, dhe 5 µL tretësirë TPP 20 ppm për cdo mL solvent, në rastin e kampioneve me peshë 5g).

56

3.6.9.1 Lakorja e kalibrimit në solvent për analizat GC-MS Përdoret tretësira e përshkruar në paragrafin 5.6.6 për ndërtimin e lakores së kalibrimit në solvent, duke e holluar në mënyrë progresive përzierjen standarde në 50 ppm me qëllim që të merren tretësirat e paraqitura në tabelën 3.5.

3.6.9.2 Lakorja e kalibrimit në solvent për analizat LC-MS/MS Përdoret tretësira e përshkruar në paragrafin 3.6.6 për ndërtimin e lakores së kalibrimit në solvent, duke e holluar në mënyrë progresive përzierjen standarde në 50 ppm me qëllim që të merren tretësirat e paraqitura në tabelën 3.6.

3.6.10.Analizat GC-MS 3.6.10.1 Kushtet instrumentale Për analizat instrumentale përdoren parametrat e mëposhtëm: Tabela 3.3 Parametrat instrumentale për GC-MS Kolonë kapilare Gaz transportues Temperatura fillestare e kolonës Programi i temperaturës

INJEKTUESI PTV Mënyra e injektimit Fluksi i sprucimit Koha e sprucimit Koha e injektimit Temperatura e injektimit Presioni i injektimit Temperatura e avullimit Presioni i avullimit Fluksi i gazit Avullues Temperatura e furrës Presioni i transportimit Zgjatja e fazës pastruese Temperatura e fazës pastruese Fluks i gazit pastrues Kufiri i temperaturës së transportit

GAZ-KROMATOGRAFI DB5-MS, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm (ose ekuivalente) 1 ml/min (Helium) 45°C Rritet deri në 180°C me 20°C/min; nga 180°C deri në 270°C me 6°C/min; nga 270°C deri në 320°C me 25°C/min; 320°C për 5‟ Solvent split 70 ml/min 1 min 0,05 min 40°C 70 kPa 40°C 70 kPa 70 ml/min Duke u rritur nga 70 në 280°C me 14,5°C/s 250 kPa 5 min Duke u rritur nga 280 a 300°C a 14,5°C/s 50 ml/min 270°C

DETEKTIMI I MASËS Përvetësimi i SCAN

57

masave Temperatura e origjinës Energjia e kolezionit

240°C 70 eV

3.6.10.2 Ndërtimi i lakores së kalibrimit: Analizohen pesë tretësirat e kalibrimit në matricë, ose në solvent të përshkruar tek tabela 5. Ndërtohet lakorja e kalibrimit për çdo analit duke cuar në abshisë vlerat e përqëndrimit të standardit dhe mbi boshtin Y raportin ndërmjet sinjalit (sipërfaqja ose gjatësia) e standardit dhe sinjalit (sipërfaqja ose gjatësia) e standardit të brendshëm. Verifikohet koeficienti i korrelacionit linear në mënyrë që të jetë (r)  0,950. Njehsimet mund të kryhen manualisht ose përmes programeve kompjuterike të pajisjes.

3.6.10.3 Kriteret e identifikimit Nëse një pik kromatografik pëmbush kriteret e mëposhtme, atëherë identifikohet me siguri të plotë si analit në test. Raporti sinjal/zhurmë: identifikimi konsiderohet i sigurt nëse të gjitha jonet e listuara në tabelën 2 për secilin analit dhe për standardin e brendshëm (326 m/z) janë të pranishme në fragmentogramën me raport S/N > 3. Përgjigjet aktuale jonike për jonet e përcaktimit sasior dhe të konfirmimit duhet të japin në të njëjtin kohë vlerën maksimale (brenda ±2 sekondave) Kohët e mbajtjes: identifikimi konsiderohet i sigurt nëse vlera e RRT është e përfshirë në intervalin 0,5% njësi RRT duke marrë parasysh vlerën mesatare të stabilizuar në fazën e kalibrimit për analitin e testit: RT n RRT = RTsp

ku: RRT = koha relative e mbajtjes; RTn = koha e mbajtjes së analitit; RTsp=koha e mbajtjes së standardit të brendshëm Nëse vlera korresponduese e RRT nuk ndodhet brenda intervalit të përmendur për pranimin e kampionit konsiderohet negative. Në këtë rast shprehet rezultati si “ I padetektuar” (< se kufiri i përcaktimit sasior, LOQ)”, e shprehur në mg/kg. Në rast se kemi indentifikim pozitiv, kryhet njehsimi i raportit jonik.

58

Raporti jonik: matet të paktën një raport i tepricës jonike ndërmjet joneve të marrë në konsideratë duke llogaritur devijimin relativ të raportit jonik R me formulën e mëposhtme: R =

R camp  Rst Rst

100

ku: Rcamp = raporti jonik i analitit të tretësirën e kampionit Rst = mesatarja e raporteve jonike të analitit në standardet e injektuara Rezultatet relative dhe analitët eventualë të karakterizuar nga një raport S/N  3 për të dy jonet e konsideruar dhe që përmbushin të gjithë kriteret të mbishkruar, në përjashtim të kriterit të raportit jonik, shprehen si “Jo i ekzaminuar: sinjal i interferuar”

3.6.10.4 Analizat sasiore Kryhen llogaritjet e përqëndrimit të çdo analiti në ekstraktin përfundimtar duke përdorur ekuacionin e lakores së kalibrimit. Llogaritjet mund të kryhen ose me dorë ose me anë të programeve të ofruara me instrumentin.

3.6.11 Analizat LC MS-MS 3.6.11.1 Kushtet instrumentale Ndarja e analitëve në test (shih tab.3) kryhet në kolonë XTerra MS C18, (3,5 m 100 x 2,1 mm) ose ekuivalente, në temperaturë mjedisi. Faza e lëvizshme, e përdorur me fluks 300 l/min, formohet nga një tretësirë acetonitrili dhe acid formik 0,1% (v/v) dhe nga një tretësirë ujore acid formik 0,1% (v/v), me gradientin e paraqitur si më poshtë: Tabela 3.4 Gradienti i fazës së lëvizshme për analizat LC-MS/MS

Koha (min) 0 8 13.5 21,5 30

Faza A1 (%) Faza B1 (%) (acid formik 0,1% në (acid formik 0,1% në acetonitril) ujë) 30 70 100 0 100 0 30 70 30 70

Ndërtimi i lakoreve të kalibrimit: analizohen 5 tretësirat e kalibrimit në matricë, të përshkruara në tabelën 6. Ndërtohet lakorja e kalibrimit për çdo analit me abshisë vlerat e përqëndrimeve të standardit dhe në ordinatë raportin ndërmjet sinjalit (sip.ose lartësi) të sinjalit në proces. Verifikohet që koeficienti

59

i korrelacionit linear ( r) të jetë  0,950. Llogaritjet mund të kryhen me dorë ose përmes programit të instrumentit.

3.6.11.2 Analizat LC-MS/MS në kampione Këto kryhen duke vepruar sic përshkruhet në paragrafin 3.6.8.1, duke vënë kolonën të paktën gjysëm ore në vlera fillestare të parametrave kromatografike. Kontrollohen parametrat relativë për të korrigjuar funksionimin e sistemit LCMS/MS (fluksi, presioni, temperatura e burimit, vakuum i sistemit masspektrometrik). Kur kushtet kromatografike janë stabël, injektohen të gjitha tretësirat e planifikuara për ndërtimin e lakores së kalibrimit (shih tabelen 3.6), kontrollin negativ (kampionin e bardhë), kontrollin pozitiv (kampionin me standard të shtuar) dhe në fund, kampionin në testim.

3.6.12 Njehsimi i përqëndrimit të analitëve Llogaritet përqëndrimi i pesticideve specifikë në kampione të shprehur në mg/kg duke përdorur formulën e mëposhtme: Cc =

C xV S

ku: Cc= përqëndrimi në mg/kg të analitit në kampione; C= përqëndrimi në g/ml i analitit në ekstraktin final; S= sasia e kampionit të analizuar, e shprehur ne gramë; V= volumi i fazës organike ekstraktuese e shprehur në mililitra. Nëse përqëndrimi i gjetur për një analit të dhënë, duke zbritur (nga pasiguria e matjes) vlerën 50% të përqëndrimit të detektuar, është mbi limitin e mbetjeve të dhëna me ligj, përsëritet analiza e kampionit duke aplikuar metodën e standardit të shtuar (shih paragrafin 5.6.12).

3.6.13 Njehsimi i sasisë së rikuperuar të analitëve Llogaritet përqindja e rikuperuar e analitëve në test për kampionin me standard të shtuar me anë të formulës: R (%)=

C

x 100

Ct

ku: R(%)= përqindja e rikuperimit të analitit; C = përqëndrimi në kampion i analitit testues (mg/kg); Ct = përqëndrimi teorik i analitit testues. Llogaritjet mund të kryhet ose me dorë ose me anë të programeve të ofruara me instrumentin. Vlera mesatare e rikuperuar e analitëve konsiderohet e pranueshme nëse merren në intervalin 60-140%. Në rastin kur një analit i dhënë ofron një rikuperim më të madh se 140% dhe kampionet e testit nuk tregojnë siguri për

60

vetë analitin, nuk është e nevojshme të rianalizohen kampionet. Në rast se merret një vlerë e rikuperuar <60% për disa analitë (maksimumi 5% e analitëve në test) mund të përjashtohet përcaktimi i vetë atyre pa përsëritjen e testit të serisë së kampioneve. Në të gjitha rastet e tjera është e nevojshme të vazhdohet me përsëritjen e serive të kampioneve të testit. Përqëndrimi i analitit në kampion është llogaritur nga regresioni linear, siç tregohet më poshtë.

Sip. e analitit/ Sip. e St. te bremd.

x

Sasia e shtuar e analitit

x: përqëndrimi absolut i analitit në kampion para shtimit të standardit të shtuar.

Figura 3.7 Kalibrimi i brendshëm duke përdorur procedurën e shtesave standarde, në mënyrë skematike.

Llogaritja e përqëndrimit të analitit me metodën e standardeve të shtuara (1)

x=

Y raporti i sipërfaqes së pikut të analitit kundrejt sipërfaqes së pikut të ISTD X Masa absolute e shtuar e analitit në μg. |x| Sasia absolute e analitit në ektraktin e mostrës (në μg) para shtesës standarde Llogaritja kryhet duke përdorur ekuacionin 2 dhe grafiku i regresionit jepet në figurën 3.5. (

)

(2)

ku : wR - masa e fraksionit të pesticidit në mostër (mg/kg)

61

c - intercepti i boshtit Y të kurbës së kalibrimit të analitit; b - pjerrësia e kurbës së kalibrimit të analitit ( 1/μg); V - volumi i acetonitrilit të shtuar ( mL) Val - volumi i alikuotave të përdorura në metodën standarde të shtesave; ma - masa fillestare e mostrës (g). Tabela 3.5 Matricat e planifikuara në fushën e aplikimit të metodës Grupet e matricës

Kategoritë e matricave Fruta me pulp

Shembuj

Fruta me bërthamë Perime me(zhardhok) Perime Perime me gjethe dhe Përmbajtje të lartë uji barishte 75-95% Gjethoret Perime me kërcell Foragjerë të freskët Gjethet e panxharit të sheqerit Kërpudha të freskëta Perime me rrënjë dhe zhardhok Me përmbajtje të lartë Bimë bishtajore të thara amidoni dhe/ose proteine dhe Drithëra dhe produkte përmbajtje të ulët uji me prejardhje të njëjtë dhe yndyrnash Fruta me përmasa të Me përmbajtje të lartë vogla kokrre acidi dhe uji Agrume Tjetër Me përmbajtje të lartë sheqernash dhe Fruta të thara përmbajtje të ulët uji Verëra Tjetër Matricat specifike

Molla, dardha, etj. Kajsi, qershi,pjeshka, kumbulla të thata, etj. Qepë Tranguj, kunguj të njomë, pjepra, domate, patëllxhan, speca, etj. Marule, spinaq, rukola, majdanoz etj. Lulelakër, brokoli, etj. Asparagus, presh, selino, etj. Jonxhë, panxhar sheqeri Gjethet e panxharit të sheqerit dhe të ngjashme Kërpudha, etj. Karota, patate Fasule, thjerrëza, etj. Gruri, elbi, orizi, bukë, makarona, biskota, etj . Luleshtrydhe, rrush etj. Portokall, limon etj. Kivi, ananas, etj. Kajsi, kumbulla të thara, konserva frutash, etj. Kafe, çaj, farë kakao dhe derivate të tij, erëza

Tabela 3.6 Jonet e përzgjedhura për analizat GC-MS

Analiti

Joni për përcaktimin sasior

Joni i parë i konfirmuar

62

Joni i dytë i konfirmuar

Aldrin Atrazina Azinphos-methyl Azinphos-ethyl Azoxystrobin Bifenox Bifenthrin Bitertanol Bromophos-methyl Brompropylate Bromuconazole Buprofezin Chlorothalonil Chlorfenvinphos Chlorpropham Chlorpyrifos-methyl Chlorpyrifos Cypermethrin (alpha) Cypermethrine Cyproconazole Cyprodinil DDD-o p‟ DDD-p p‟ DDE-o p„ DDE-p p‟ DDT-o p' DDT-p p‟ Deltamethrin Diazinon Dichlofluanid Dichlorobenzopheno ne-4 4' Dichlorvos Diclobutrazol Dicloran Dicofol Dieldrin Dimethoate Disulfoton Endosulfan sulphate

66 200 132 160 344 341 181 170 331 341 173 105 266 267 127 286 197 163 163 222 224 235 235 246 246 235 235 181 304 123

263 215 160 77 388 343 165 168 329 339 175 172 264 269 129 288 199 181 181 139 225 237 237 248 248 237 237 253 137 167

265 202 77 132 372 189 166 171 333 343 295 106 268 323 213 125 314 164 164 244 226 165 165 318 318 165 165 255 179 224

139 109 270 176 139 79 125 88 272

250 185 272 178 141 263 93 142 274

141 187 159 206 193 277 87 186 270

63

Endosulfan-alpha Endosulfan-beta Endrin Esfenvalerate Ethion Etofenprox Etrimfos Fenamiphos Fenarimol Fenazaquin Fenchlorphos Fenitrothion Fenthion Fenvalerate Fluvalinate-tau HCH-alpha HCH-beta HCH-gamma (Lindane) Heptachlor Hexachlorobenzene Hexaconazole Iprodione Isodrin Lambda-cyhalothrin Malaoxon Malathion Metalaxyl Mevinphos Mirex Myclobutanil Parathion Parathion-methyl Pendimethalin Permethrin Phorate Phosalone Pirimiphos-methyl Procymidone Profenofos Propiconazole

241 195 263 181 231 163 292 154 139 145 285 277 278 125 250 181 181 181 100 284 214 187 193 181 127 173 206 127 272 179 291 263 252 183 121 182 290 285 208 173

237 237 81 152 153 135 153 303 219 160 287 109 125 167 181 183 183 183 272 286 83 189 263 197 99 125 160 192 274 150 109 125 281 163 260 184 276 283 339 175

64

195 241 265 125 97 164 181 217 251 146 125 125 109 127 252 217 217 217 274 282 216 243 265 208 125 127 192 109 237 181 97 109 162 165 231 121 305 96 206 259

Propoxur Propyzamide Prothiophos Pyrimethanil Quinalphos Quinoxifen Quintozene Sulfotep Tebufenpirad Tecnazene Terbufos Tetradifon Tolylfluanid Transheptachlor epoxide Triadimefon Triadmenol Trifluralin Vinclozolin

110 173 113 198 146 237 237 322 318 203 231 159 137 183 208 112 306 212

152 175 162 199 157 272 297 202 333 215 153 356 238 185 56 128 264 214

111 255 309 200 156 307 293 238 276 261 186 354 181 253 210 168 307 285

Renditja e joneve për çdo analit të raportuar është thjesht treguese. Për secilin grup të matricave të Tabelës 3.5 mund të merret si jon i përcaktimit sasior njëri nga tre jonet e treguara për secilin analit. Tabela 3.7 Kalimet jonike dhe parametrat tregues elektrikë për monitorimin në LC-MS/MS të analitëve specifik në pesticide (faza e lëvizshme 1 - kolona xterra) Tranzicioni I Analiti Azoxystrobin Carbaryl Chlorpyrifos Diazinon Dichlorvos Difenoconazole Epoxiconazole Fenbuconazole Fenhexamid Fenitrothion Fenpropimorph Fluquinconazole Flusilazole Flutriafol Hexaconazole Imazalil

Prekuso r 403.9 202.0 350.2 305.2 221.0 406.0 330.2 337.3 302.2 278.0 304.4 376.0 316.2 302.2 314.2 297.0

Produkt

CE

CXP

371.9 144.9 97.0 169.0 109.1 251.0 121.0 125.0 97.1 125.0 147.0 349.2 247.0 70.0 70.0 159.0

36 15 55 29.8 25 35 33 53 33 30 39.8 27 29 43 48 34

20 8 18 9.97 10 22 7 8 5 11 15 16 7 7 7 14

65

Tranzicioni C Produkt E 344.0 29 127.0 17 198.0 35 153.0 29 127.1 26 337.2 25 123.3 29 70.0 43 55.1 63 246.0 25 117.0 71 307.1 34 165.2 37 233.0 22 159.0 40 255.0 26

II

Tranzicioni I-II

CXP

DP

FP

EP

20 8 34 15 13 5 7 6 10 20 12 22 10 22 13.5 21

80 11 23 54 58 63 48 60 54 81 51 58 46 65 70 68

100 100 192 295 258 365 230 310 240 340 200 340 250 329 290 185

10 10 6 8 12 9 10 8 11 10 10 10 11 11 9 6

Isoproturon

206.9

72.0

33

7

165.2

21

16

75

350

13

Kresoxim- methyl

314.2

206.0

10

20

267.2

10

17

45

400

17

Metconazole Metribuzin Penconazole Pendimethalin Pirimiphosmethyl Prochloraz Profenofos Propiconazole Pyraclostrobin Spiroxamine Tebuconazole Tebufenozide Terbufos Triadimenol Triazophos Triphenylphosphat e Trifloxystrobin Triticonazole

320.0 215.0 284.2 282.2

70.0 187.2 159.0 212.0

50 25 40 16

7 18 14 13

177.0 131.0 70.0 194.0

31 30 44 27

17 12 7 15

65 50 54 30

194 314 344 269

13 15 8 5

306.2

164.3

31

16

108.1

42

10

58

200

10

376.1 373.1 342.0 388.3 298.3 308.3 353.2 289.1 296.0 314.1

266.0 302.9 159.0 163.0 144.2 70.0 297.3 102.9 70.0 162.2

24 27 39 34 30 46 10 13 41 26

18 8 16 12 13 6 17 5 7 10

308.1 345.0 69.0 194.0 100.0 151.0 133.2 232.9 227.0 286.1

17 19 39 19 44 35 31 9 14 19

27 10 6 12 10 8 9 17 16 9

49 25 59 45 65 52 47 30 31 22

385 145 355 215 329 365 335 175 220 124

5 15 12 8 7 6 4 5 5 11

327.3

77.3

40

19

/

/

/

45

100

10

409.2 318.1

186.1 69.9

25 40

16 6

206.1 125.0

21 44

19 12

47 50

363 282

8 7

CE (collision energy); CXP (collision cell exit potential); DP (declustering potential), EP (entrance potential).

66

Tabela 3.8 Kalimet jonike dhe parametrat tregues elektrikë për analizat LCMS/MS (faza e lëvizshme 2 - kolona synergy). Tranzicioni I

Tranzicioni II

Tranzicioni I-II

Analiti

Prekusor

Produkt

CE

CXP

Produkt

CE

CXP

DP

FP

EP

Aldicarb

208.1

89.1

21

6

116.0

13

6

11

100

10

Benomyl Buprofezin

291.3

192.1

21

20

160.0

35

13

45

320

4

306.3

201.0

19

16

116.0

25

11

32

150

5

Carbaryl

202.0

144.9

15

8

127.0

17

8

11

100

10

Carbendazim

192.0

160.1

36

19

132.1

42

13

48

294

5

Carbofuran

222.1

165.1

17

8

123.0

29

8

16

100

10

Chlorpyrifos

350.2

97.0

55

18

198.0

35

34

23

192

6

Deltamethrin

523.1

281.0

23

7.5

479.0

17

7

52

305

8

2,6Dichloro benzamide

190.2

173.0

27

11

145.0

41

10

48

240

9

Dimethoate Fluopicolide

230.1

199.0

15

13

125.0

31

8

20

130

11

383.2

173.0

35

11

365.0

23

11

53

260

11

Fluroxypir

255.0

237.0

17

14

209.0

23

14

42

395

13

Fenhexamid

302.2

97.1

33

5

55.1

63

10

54

240

11

Fenitrothion

278.0

125.0

30

11

246.0

25

20

81

340

10

Iprodione

330,0

245,1

20

20

187,8

40

14

67

350

8

Malaoxon

315.2

127.0

19

24

99.0

35

19

24

130

10

Malathion

331.1

127.0

19

7

99.0

32

5

26

118

9

Methacrifos

258.1

209.0

19

14

125.0

37

7

12

105

13

Methomyl

163.1

88.0

13

7.5

106.0

15

10

49

281

5

Methiocarb

243,0

169.0

17

8

/

/

/

11

100

10

Methiocarb

226.0

/

/

/

121.0

25

8

61

100

100

Omethoate Pirimicarb

214.2

183.0

17

15

154.9

23

15

36

138

13

239.2

71.9

32

7

182.1

23

11

85

400

9

Pirimicarb desmethyl

224.9

71.9

33

7

168.2

21

16

85

391

11

Profenofos

373.1

302.9

27

8

345.0

19

10

25

145

15

Propamocarb

189.3

102.1

27

10

144.0

19

13

18

120

10

Propoxur Pyrimethanil

210.2

168.1

13

11

110.9

21

6

20

120

14

200.0

107.0

35

10

183.0

34

15

50

275

12

Quinoxifen

308.1

197.0

47

13

272.0

37

7

40

185

11

Terbufos

289.1

102.9

13

5

232.9

9

17

30

175

5

Thiabendazole

201.9

175.0

36

13

131.0

46

9

56

260

6

Thiodicarb

355.0

88.0

25

8

106.0

24

11

46

220

9

Thiophanate- methyl

343.1

151.0

27

14

192.0

24

13

40

400

15

Triphenyl phosphate

327.3

77.3

40

19

/

/

/

45

100

10

Triadimefon

294.2

197.2

27

10

69.0

19

13

18

120

10

CE (collision energy); CXP (collision cell exit potential); DP (declustering potential), EP (entrance potential)

67

Tabela 3.9 Përqëndrimet e pesticideve në tretësirat e kalibrimit për GC-MS.

Lakorja në Matricë ST1-GC ST2-GC ST3-GC ST4-GC ST5-GC

Përqëndrimi i Standardit të pesticideve (mg/kg) 0,01 0,02 0,10 0,50 1,00

Përqëndrimi i Standardit të brendshëm (mg/kg) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Tabela 3.10 Përqëndrimet e pesticideve në tretësirat e kalibrimit për LC-MS/MS

Lakorja në Matricë ST1-LC ST2-LC ST3-LC ST4-LC ST5-LC

Përqëndrimi i standardit të pesticideve (mg/kg) 0,01 0,02 0,10 0,50 1,00

Përqëndrimi i standardit të brendshëm (mg/kg) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Tabela 3.11 Kriteret e pranimit të raporteve GC-MS

Intensiteti relativ (% e sinjalit më intensiv ) > 50% >20% - 50% > 10% - 20% < 10%

Toleranca maksimale  10%  15%  20%  50%

Tabela 3.12 Kriteret e pranimit të raporteve LC-MS-MS

Intensiteti relativ (% e sinjalit më intensiv ) > 50% >20% - 50% > 10% - 20% < 10%

Toleranca maksimale  20%  25%  30%  50%

68

Skema 3.8 Skema analitike për metodën QuEChERS

69

3.7 PËRPUNIMI STATISTIKOR I REZULTATEVE Rezultatet e marra janë përpunuar sipas programit të certifikuar nga QUALAB, (www.qualab.ch) AZR&IBQC. Format i përgatitur nga laboratorë të akredituar në bazë të standardeve ISO/IEC 17025:2005 (autorët:Mikael Krysell dhe Karsten Wienecke. Një shembull i formatit është paraqitur në figurat më poshtë (figura 3.9; figura 3.10).

Figura 3.9 Programi i përdorur për përpunimin statistikor të të dhënave (pjesa I)

70

Figura 3.10 Programi i përdorur për përpunimin statistikor të të dhënave (pjesa II)

71

3.7 VLERËSIMI I METODËS 3.7.1 Plani i vlerësimit Plani i vlerësimit të metodës përfshin ato parametra të cilët duhet të përcaktohen duke u nisur nga karakteri i metodës që do të përdoret, nëse metoda është e vlerësuar në një laborator reference është e nevojshme që për këtë metodë të përcaktohen parametrat e vlerësimit dhe të verifikohen nëse ato përmbushin kriterin për të cilin përdoren. Tabela 3.11 Parametrat e vlerësimit.

Parametrat Lineariteti Efekti matricë LOQ Specificiteti Precizioni Saktësia

Çfarë / Si

Kriteret

Nëpërmjet kurbës së kalibrimit Krahasimi ndërmjet kurbës së kalibrimit në solvent dhe në matricë Niveli më i ulët I përqendrimit për të cilin kanë qenë të demonstruar saktësia dhe precizoni Reagimi në kontrollin negativ Ripërsëritshmëria për të gjitha nivelet e fortifikimit Rifitimi mesatar për të gjitha nivelet e fortifikimit

R ≤ 0.95 ≤MRL < 30% e LOQ RSD% ≤ 20% 70-120%

Shënim: Tabela është nxjerrë nga dokumenti SANCO nr. 12571/2013, e cila përmbledh parametrat dhe kriteret e kërkuara në fazën e vlefshmërisë së metodës.

3.7.1.1 Specificiteti: Mungesa e interferencës së komponimeve në një maksimum tolerance prej ± 2.5%. Përcaktohet duke analizuar të paktën 20 kampione “blank” të matricave përfaqësuese me përmbajtje të lartë uji krahasur me standardin dhe/ose mostrën e fortifikuar. 3.7.1.2 Limiti i detektimit (LOD): Përmbajtja më e vogël e matur, nga të cilat është e mundur të nxirret një përfundim për praninë e analitit. LOD është numerikisht e barabartë me tri herë devijimin standard të mesatares së përcaktimeve të blank-ut (n> 20). 3.7.1.3 Limiti i kuantifikimi (LOQ): përmbajtja më e ulët e analitit e cila mund të matet me siguri të arsyeshme statistikore. Kufiri i kuantifikimit është vendosur numerikisht si MRL 0,01 mg/kg për të gjitha komponimet në mostër.

72

3.7.1.4 Lineariteti: do të vlerësohet duke injektuar tri herë, të paktën pesë solucione standarde në rangun 0-1000 mg/kg për çdo komponim në matricë. 3.7.1.5 Përsëritshmëria (precizioni): do të përcaktohet duke përgatitur një grup mostrash të materialit të specifikuar të fortifikuara me analitin në përqëndrimet e barabarta me 0,005, 0,01, 0,02 dhe 0,10 (mg/kg). Në çdo nivel analiza duhet të kryhet me të paktën pesë replikime. 3.7.1.6 Rifitimi: Vlerësohet duke përdorur matricat blank (të bardha) me fortifikim në të tri nivelet e përqëndrimit (L1, L2 dhe L3) dhe injektohet në gjashtë përsëritje.

73

KAPITULLI IV. REZULTATE DHE DISKUTIME 4.1 REZULTATET MBI VLERËSIMIN E PARAMETRAVE TË METODAVE . 4.1.1 Metoda KadenCzky: Metoda Kadenczky u vlerësua për dy kulturat (domate, spec) dhe për të dy pesticidet në studim (imidakloprid dhe acetamiprid). Pra, mbetjet e pesticidit imidakloprid në domate u analizuan me metodën Kadenczky dhe gjithashtu mbetjet e acetamipridit në spec u analizuan po me këtë metodë. E njëjta analizë u zhvillua edhe me metodën tjetër të ekstraktimit, metoda me etil acetat (SweEt). I njëjti pesticid në të njëjtën kulturë është analizuar me dy metodat e ekstraktimit dhe përcaktimit. Në këtë mënyrë mund të bëjmë krahasimin ndërmjet metodave. Tabela 4.1 Rezultatet mbi vlerësimin e parametrave të metodës Kadenczky. Kriteret e kërkuara të performancës së metodës

REZULTATET Acetamiprid në spec <10% e LOQ

Imidakloprid në domate <10% e LOQ

Specificiteti

<30% e LOQ

Lineariteti

R2 ≥ 0.995

LOD

0.01 mg/kg

LOQ

0.03 mg/kg

0.015 mg/kg

0.017 mg/kg

Riprodhueshmëria

RSD ≤ 20 %

7.19 %

4.64 %

Ripërsëritshmëria

RSD ≤ 20 %

4.99 %

3.48 %

Rifitimi

70 – 120 %

88.01 %

86.14 %

0.996 0.0078 mg/kg

0.998 0.0089 mg/kg

Specificiteti: Mungesa e interferencës së komponimeve në një maksimum tolerance prej ± 2.5%. U përcaktua duke analizuar të paktën 20 kampione “blank” të matricave përfaqësuese me përmbajtje të lartë uji krahasuar me standardin dhe/ose mostrën e fortifikuar <30% e LOQ. Identifikimi fillestar i piqeve të analitëve u krye duke u bazuar në kohët e retensionit. Në figurat e mëposhtme jepen shembuj të kromatogramave për tretësirat standarde

74

acetamiprid, imidakloprid, si dhe kohët e retensionit për analitët, në kushtet konkrete. 6.0

uV(x1,000,000) Chromatogram

5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

min

Figura 4.1 Kromatogramë përfaqësuese për mostrën e bardhë, spec. uV(x100,000) 8.0 Chromatogram

ACETAMIPRID

7.0

6.0

5.0

4.0

3.0

2.0

1.0

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

min

Figura 4.2 Kromatogramë përfaqësuese e standardit acetamiprid në tretës në përqëndrimin 0.3 mg/kg, koha e retensionit në kushtet e propozuara është 7.297min uV(x10,000) 5.0 Chromatogram 4.0

acetamiprid

3.0 2.0 1.0 0.0 2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

min

Figura 4.3 Kromatogramë përfaqësuese e standardit acetamiprid në mostrën e analizuar (spec). Koha e mbajtjes është 7.286 min.

75

imidacloprid/1.524

mAU 252nm,4nm (1.00) 50

/4.470

25

0

0.0

2.5

5.0

7.5

min

Figura 4.4 Kromatogramë përfaqësuese e standardit imidakloprid në tretës në përqëndrimin 0.5 mg/kg, koha e mbajtjes në kushtet e propozuara është 1.524min

1000

500 250

/1.314

750

/6.492

1250

/2.271

Imidacloprid/1.591

mAU 210nm4nm (1.00)

0

0.0

2.5

5.0

7.5

min

Figura 4.5 Kromatogramë përfaqësuese e standardit imidakloprid në mostrën e analizuar (domate). Koha e mbajtjes është 1.591 min gjë e cila tregon specificitetin e metodës për analizimin e analitit imidakloprid.

LOD dhe LOQ: Për matjen e kufirit të detektimit (LOD), solucionet standarde në nivele shumë të ulëta të përqëndrimit: 0.1, 0.5, 1.0, μg/ml u injektuan deri sa sinjali i marrë të ishte tri herë sa devijimi standard i sfondit. Për matjen e kufirit të kuantifikimit (LOQ), përsëri përqëndrime të njohura të standardit janë injektuar deri në sinjale të riprodhueshme për pesë injeksione.

76

5.0

uV(x10,000) Chromatogram

4.5

4.0

Acetamiprid

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

-0.5

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

min

Figura 4.6 Kromatogramë e ekstrakteve 0.01, 0.05, 0.1 mg/kg për përcaktimin e nivelit të përcaktimit (LOQ). Niveli i përcaktimit për analitin acetamiprid analizuar me metodën Kadenczky u llogarit në 0.05 mg/kg .Niveli maksimal i lejuar për këtë substancë në spec është 0.3 mg/kg. (Ref.: EU Pesticides database) mAU 1(#1) 2(#1) 900 3(#1) 4(#1) 5(#1) 800

Ch1 Ch1 Ch1 Ch1 Ch1

254nm 254nm 254nm 254nm 254nm

700 600 500 400 300 200 100 0 1.25

1.50

1.75

2.00

Figura 4.7 Kromatogramë e ekstrakteve 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0 mg/kg për evidentimin e nivelit të përcaktimit (LOQ). Niveli i përcaktimit për analitin imidakloprid analizuar me metodën Kadenczky u llogarit në 0.05 mg/kg. Niveli maksimal i lejuar për këtë substancë në domate është 0.5 mg/kg. (Ref.: EU Pesticides database)

Rifitimi: U vlerësua duke përdorur matricat blank (të bardha) me fortifikim në dy nivele të përqëndrimit 0.1 dhe 0.5 mg/kg dhe u injektua në pesë përsëritje. Kuantifikimi është bërë duke përdorur standard të jashtëm. Rifitimi mesatar për acetamipridin në spec me metodën Kadenczky është 88%. Dhe për imidakloprid në domate me metodën Kadenczky është 86%. Përsëritshmëria (saktësia): Është matur në një grup mostrash të materialit të specifikuar, të fortifikuara me analitin në përqëndrimet e barabarta 77

me 0,05, 0,1, 0,2 dhe 1.0 mg/kg. Në çdo nivel analiza u krye me pesë përsëritje. Përsëritshmëria është shprehur si devijim standard relativ (RSD%) në rezultatet prej 5 replikateve në 0.1mg/kg. RSD% e llogaritur për imidaklopridin në domate është 3.48% dhe për acetamipridin në spec është 4.99%. Testi i linearitetit dhe kurba e kalibrimit: Lineariteti u vlerësua duke injektuar tre herë, të paktën pesë solucione standarde në rangun 0-10 mg/kg. Përcaktimi sasior është bërë në standarde të tretura në matricën e punës (spec). Metoda tregon linearitet mbi 0.01mg/kg. Është përmbushur kriteri për pranimin e linearitetit (R2 ≥ 0.95). Kalibrimi u krye me metodën me standard të jashtëm, me 5 nivele përqëndrimesh. Përqëndrimet e tretësirave standarde të përdorura për kalibrim jepen në tabelën e mëposhtme. Llogaritja e linearitetit është kryer duke përdorur zonat lineare, ndërsa përcaktimi sasior është bazuar në metodën me standard të jashtëm. Tabela 4.2 Përqëndrimet e tretësirave standarde të përdorura për kalibrim.

Emri Acetamiprid Imidakloprid

Koha Rt C1 (min) (mg/kg) 7.297 0.107 1.524 0.10

C2 (mg/kg) 0.493 0.50

C3 (mg/kg) 1.987 1.0

C4 (mg/kg) 5.174 1.25

C5 (mg/kg) 10.1616 2.0

Area Area

900000

Acetamiprid

10000000

Imidakloprid

800000 700000 600000

7500000

500000 400000 5000000

Y= aX + b a = 1.879296e-007 b =-7.484069e-002 R2 = 0.9978168

2500000

0 0.0

200000 100000 0 0.0

0.5

1.0

1.5

Y = aX + b a = 2.038266e-006 b = -8.793676e-003 R2 = 0.9988

300000

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

Conc.

Conc.

Figura 4.8 Kurba e kalibrimit dhe ekuacioni përkatës për standardet acetamiprid dhe imidakloprid.

Saktësia: U përcaktua nga përsëritshmëria e 5 mostrave të të njëjtit përqëndrim në të njëjtat kushte dhe nga një seri injektimesh.

78

5.0

uV(x10,000) Chromatogram

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

-0.5

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

min

Figura 4.9 Mbivendosje e kromatogramave për një seri injektimesh. me një devijim standard relativ RSD = 0.51%.

4.2 REZULTATET MBI VLERËSIMIN E PARAMETRAVE TË METODËS SË EKSTRAKTIMIT ME ETIL ACETAT (SweEt) E njëjta procedurë vlerësimi (si metoda kadenzcky) u realizua edhe për metodën e ekstraktimit me etil acetat (metoda SweEt) dhe rezultatet e marra nga vlerësimi i parametrave të metodës janë paraqitur më poshtë. Tabela 4.3 Rezultatet mbi vlerësimin e parametrave të metodës me etil acetat (SweEt). Kriteret e kërkuara të performancës së metodës

REZULTATET Acetamiprid në spec <10% e LOQ

Imidakloprid në domate <20% e LOQ

Specificiteti

<30% e LOQ

Lineariteti

R2 ≥ 0.995

0.995

0.979

LOD

0.01 mg/kg

0.0097 mg/kg

0.0128 mg/kg

LOQ

0.03 mg/kg

0.019 mg/kg

0.024 mg/kg

Riprodhueshmëria

RSD ≤ 10 %

8.42 %

5.82 %

Ripërsëritshmëria

RSD ≤ 5 %

4.76 %

2.12 %

Rifitimi

70 – 120 %

99.01 %

96.21 %

Specificiteti: Mungesa e interferencës së komponimeve në një maksimum tolerance prej ± 2.5%. U përcaktua duke analizuar të paktën 20 kampione “blank” të matricave përfaqësuese me përmbajtje të lartë uji krahasur me standardin dhe/ose mostrën e fortifikuar. <30% e LOQ. Identifikimi fillestar i piqeve të analitëve u krye duke u bazuar në kohët e retensionit. Në figurën 4.10 jepet kromatograma e një tretësire standarde, si dhe koha e retensionit për analitin, në kushtet konkrete.

79

/1.901

mAU 210nm,4nm (1.00) 200

150

100

50

0

0.0

2.5

5.0

7.5

mi n

Figura 4.10 Kromatograma për standardin imidakloprid.

7.297

uV (x100,000) Chromatogram 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75

0.00

6.967

0.25

7.595

0.50

7.00

7.25

7.50

7.75

8.00

8.25

8.50

min

Figura 4.11 Kromatograma për standardin acetamiprid.

LOD dhe LOQ: Për matjen e kufirit të detektimit (LOD), solucionet standarde në nivele shumë të ulëta në nivelet e përqëndrimit të: 0.1, 0.5, 1.0, μg/mL u injektuan deri sa sinjali i marrë të ishte tri herë sa devijimi standard i sfondit. Për matjen e kufirit të kuantifikimit (LOQ) janë injektuar përsëri përqëndrime të njohura të standardit deri në sinjale të riprodhueshme për pesë injeksione. .RIFITIMI: U vlerësua duke përdorur matricat blank (të bardha) me fortifikim në dy nivele të përqëndrimit 0.01 dhe 0.05 mg/kg dhe u injektua në pesë përsëritje. Kuantifikimi është bërë duke përdorur standard të jashtëm. Rifitimi mesatar në 0.01mg/kg për imidakloprid në domate me metodën SweEt është 93%. Testi i linearitetit dhe kurba e kalibrimit: Testi i linearitetit është marrë në matricën e përgjithshme. Metoda tregon linearitet mbi 0.1mg/kg për imidaklopridin në domate me HPLC-UV. Është përmbushur kriteri për pranimin e linearitetit (R2 ≥ 0.95) .

80

Tabela 4.4 Përqëndrimet e tretësirave standarde të përdorura për kalibrim.

Emri

Acetamiprid Imidakloprid

Koha Rt (min) 7.57 1.82

C1 (ng/g)

C2 (ng/g)

C3 (ng/g)

C4 (ng/g)

C5 (ng/g)

10 10

50 50

100 100

200 200

500 500

Imidakloprid 80,0000

140,0000

70,0000

120,0000

60,0000

100,0000

50,0000

80,0000

40,0000 30,0000

60,0000 20,0000

y = 0,1391x - 2,622 R² = 0,9878

y = 0,0636x - 0,2948 R² = 0,9946

20,0000 10,0000 0,0000

0,0000 -20,0000 0

1000 1000

Acetamiprid

160,0000

40,0000

C6 (ng/g)

500 1000 Përqëndrimi (ng/ml)

0

1500

500 1000 Përqëndrimi(ng/ml)

1500

Figura 4.12 Kurba e kalibrimit për standardin imidakloprid dhe acetamiprid analizuar me metodën me etil acetat.

Përsëritshmëria është shprehur si devijim standard relativ (RSD%) në rezultatet prej 5 replikateve për analitin e përfshirë. RSD e llogaritur në 0.01mg/kg (n=15) është 4.76% për imidakloprid në domate dhe 2.12% për acetamiprid në spec. Konfirmim i pranisë së imidaklopridit me LC-MS. Mostrat e fortifikuara u injektuan në LCMS për të konfirmuar detektimin e imidaklopridit në domate.

81

imidaclopride #1 RT: 0.00 AV: 1 NL: 2.33E6 T: {0,0} + c ESI !corona sid=75.00 det=847.00 Full ms [100.00-1000.00]

RT: 0.00 - 11.99 SM: 11G RT: 4.20

100

NL: 3.53E5 m/z= 254.50255.50 MS ICIS imidacloprid e

95 90 85 80

170 160 150 140

75

130

70

120

60

110

Relative Abundance

Relative Abundance

65

55 50 45 40

224.15

100 90 80 70

35

60

30

RT: 5.30

25

50

RT: 5.99

20

40

RT: 7.51

15

RT: 8.02

30 RT: 10.17

10

20

RT: 0.90 RT: 2.30

0

225.14 228.14

208.26

10

5

0 0

2

4

6 Time (min)

8

10

200

Figura.4.13.Kromatograma e marrë nga konfirmimi në LC/MS për imidakloprid në domate

220

236.15 249.17 261.15 240

260 m/z

278.24 289.02 300.97 280

317.05

300

320

Figura 4.14.Spektri i masës për imidakloprid.

4.3 REZULTATET E VLERËSIMIT TË METODËS QuEChERS 4.3.1 Optimizimi I Kushteve Instrumentale HPLC-MS/MS Jonizimi ESI (electrospray ionization) në formën pozitive ka dhënë një përgjigje adekuate për të gjitha jonet e interesit. Temperatura e burimit të joneve e vendosur në 350° C me një tension të aplikuar në 5500 V, siguroi jonizimin të gjithë analitëve, duke ruajtur fragmentimin dhe degradimin në burim duke bërë të mundur që jonet molekulare të hyjnë në detektor. Qëllimi i një metode shumëmbetjesh është për të përcaktuar numrin më të madh të mundshëm të analitëve në një rrugëtim të vetëm kromatografik, megjithatë ishte e domosdoshme për të kryer dy rrugëtime në dy kolona të veçanta. Analitë të tillë si carbendazim, omethoate dhe dimethoate paraqesin piqe asimetrike në kolonën C18 për shkak të një lidhje hidrofilike me grupet hidroksile të mbetjeve silice. Të gjithë analitët janë identifikuar nga tre jone diagnostike, një jon molekular dhe dy fragmente duke plotësuar kështu kriteret e vendosura nga dokumenti SANCO nr. 12571/2013 (figura 4.15)

82

Figura 4.15 Kromatograma për Fensulfothion sulfone. Standard në matricë 1 μg/kg.; majtas jonet e kuantifikimit dhe konfirmimit; poshtë djathtas-joni i kuantifikimit të standardit të brendshëm (TPP).

Disa analitë (acefat, metil thiofanate, phosmet, pendimethalin) kanë dhënë një fragment të vetëm, të pamjaftueshëm për një metodë konfirmuese; për këtë arsye, ata janë analizuar në GC-MS/MS. I njëjti problem u gjet në HPLCMS/MS për aldicarb sulfone dhe imidakloprid. në mënyrë që të merren tre pikat e identifikimit, ata u përcaktuan me ndryshimin e fazës lëvizëse (nga acide në bazike), pasi këto analitë nuk mund të përcaktohen me anë të gaz kromatografisë.

4.3.2 Optimizimi I Kushteve Instrumentale GC-MS/MS Të gjithë analitët kanë dhënë ndjeshmëri të mjaftueshme për të përmbushur limitet maksimale të mbetjeve të kërkuara nga legjislacioni aktual. Si për përcaktimin në HPLC-MS/MS, analitët janë identifikuar duke përdorur tre jonet diagnostike (tabela 3.6). Për disa prej tyre (lufenuron, chlorothalonil, iprodione) mundësia e ndarjes me anë të dritareve kohore (fragmente) ka mundësuar identifikimin e deri në pesë joneve diagnostike.

83

Figura 4.16 Fragment nga metoda e zhvilluar instrumentale MRM (Multi Reaction Monitoring) Për iprodione janë fragmentuar dy jone mëmë të ndryshme : joni me m/z = 187.0, prej ku merren jonet bijë me m/z = 124.1 dhe 159.2 dhe joni i dytë mëmë me m/z = 314.0, i cili jep fragmentet me m/z = 245.3 dhe 271.4.

4.3.3. Lineariteti dhe efekti matricë 4.3.3.1. Lineariteti Lineariteti në fushën e aplikimit të metodës (nga 1/10 mg / kg në 250/1000 mg/kg) u verifikua për të dy rastet (në tretës dhe në matricë). Të gjithë analitët e hetuar kanë dhënë një koeficient korrelacioni në matricë > 0,95 (përveç për folpet, captan dhe dichlofluanid, këta të fundit janë të përcaktueshëm vetëm në GC dhe janë të ndjeshëm me kushtet e aktivizimit të Liner-it (degradim). Këtu janë dhënë disa shembuj të kurbave të kalibrimit për disa analitë (Figura 4.17)

84

Dimethoate-kurba e kalibrimitintervali 5-1000 ppb

Methomyl , kurba e kalibrimitintervali 5-1000 ppb

0,0060

140,0000

0,0050

120,0000 100,0000

0,0040 y = 0,117x - 3,0727 R² = 0,9752

80,0000 60,0000

0,0030

40,0000

0,0020

20,0000

0,0010

0,0000 -20,0000 0

200

400

600

y = 4E-06x - 0,0002 R² = 0,9503

800

1000

1200

0,0000 0

200

400

600

800

1000

1200

-0,0010 përqëndrimi (ng/g)

përqëndrimi (ng/g)

Carbaryl intervali 5-1000 ppb

Fluroxypir-kurba e kalibrimit intervali 5-1000 ppb 0,0060

60,0000

0,0050

50,0000 y = 4E-06x - 0.0002 R² = 0.9593

0,0040 0,0030

30,0000

0,0020

20,0000

0,0010

10,0000

0,0000 -0,0010

0

200

400

600

y = 0,0497x - 1,0264 R² = 0,9837

40,0000

800

1000

1200

0,0000 0

200

400

600

800

1000

1200

-10,0000 përqëndrimi (ng/g)

përqëndrimi (ng/g)

Buprofezine intervali 5-1000 ppb

Benomyl - intervali 5-1000 ppb

250,0000

0,0060 0,0050

200,0000

y = 4E-06x - 0,0002 R² = 0,9493

0,0040 y = 0,1917x - 0,1197 R² = 0,9904

150,0000

0,0030 0,0020

100,0000

0,0010

50,0000

0,0000 0

0,0000 0

200

400 600 800 përqëndrimi (ng/g)

1000

1200

200

400

600

800

1000

1200

-0,0010 përqëndrimi (ng/g)

Figura 4.17 Kurbat e kalibrimit të disa analitëve (dimethoate, methomyl, fluroxypir, carbaryl, buprofezine, benomyl, aldicarb e chloropyriphos) në matricë në të gjithë intervalin e aplikimit të metodës. Grafikët tregojnë sinjalin (sipërfaqe e analitit / sipërfaqe e SB) në funksion të përqëndrimit të vetë analitit (ng/g).

85

Tabela 4.5 Ekuacioni i vijës së kalibrimit për disa analitë, në rangun 10-1000 µg/kg (tretës dhe matricë). Tabela tregon ekuacionin e vijës dhe vlerën e koeficientit të korrelacionit (r). Matricë

Tretës

Analiti

Ekuacioni i vijës

r

Ekuacioni i vijës

r

Aldrin

y = 1.024e-1x-7.215e-5

0.9987

y = 1.244e-1x-7.294e-5

0.9988

Cadusafos

y = 1.576e-1x+1.416e-4

0.9937

y = 1.804e-1x+1.931e-4

0.9972

Demeton-S-methyl

y = 0.0933 x + 0.18621

0.9984

-

-

Demeton-S-methyl sulfone

y = 0.0743 x + 0.01655

0.9962

-

-

Dieldrin

y = 1.423e-1x+1.294e-3

0.9903

y = 1.423e-1x+1.234e-3

0.9986

Disulfoton

y = 1.031e-1x+1.241e-5

0.9978

y = 1.875e-1x+1.205e-5

0.9981

Disulfoton sulfone

y = 1.519e-1x-1.373e-5

0.9982

y = 1.571e-1x-1.134e-5

0.9983

Disulfoton sulfoxide

y = 2.19e-1x-1.416e-4

0.9937

y = 2.439e-1x-1.386e-4

0.9942

Endrin

y = 1.864e-1x+1.211e-4

0.9954

y = 1.875e-1x+1.230e-4

0.9957

Ethoprophos

y = 1.883e-1x+1.202e-5

0.9983

y = 1.894e-1x-1.231e-5

0.9981

Fensulfothion

y = 0.0547 x + 0.0532

0.9984

y = 0.0731 x + 0.0312

0.9923

Fensulfothion oxon

y = 0.0943 x + 0.0162

0.9909

y = 0.0406 x + 0.0067

0.9923

Fensulfothion oxon sulfone

y = 0.0502 x + 0.0004

0.999

y = 0.0753 x + 0.0162

0.9906

Fensulfothion sulfone

y = 0.0307 x + 0.0054

0.9935

y = 0.0936 x + 0.0043

0.9938

Fipronil

y = 2.657e0x-1.134e-5

0.9978

y = 2.693e0x-1.295e-5

0.9987

Fipronil desulfinyl

y = 2.669e0x-5.156e-4

0.9979

-

-

Heptachlor

y = 1.113e0x-3.974e-5

0.9945

y = 1.093e0x-3.874e-5

0.9923

Hexachlorobenzene

y = 1.243e0x-3.754e-5

0.9942

y = 1.093e0x-2.792e-5

0.9945

Nitrofen

y = 1.474e0x-1.464e-4

0.9963

y = 1.463e0x-1.954e-4

0.9936

Omethoate

y = 0.1943 x + 0.0356

0.9978

-

-

Oxydemeton-methyl

y = 0.1453 x + 0.4312

0.9987

y = 0.1765 x + 0.4675

0.9976

Terbufos

y = 2.096e0x-1.934e-5

0.9952

y = 1.823e0x-1.842e-5

0.9988

Terbufos sulfone

y = 1.093e0x-3.754e-4

0.9983

-

-

Trans-heptachlor

y = 1.133e0x-3.844e-5

0.9985

-

-

Nga tabela mund të shihet se kurba e kalibrimit në matricë rezulton të jetë lineare në intervalin e matjes

4.3.3.2. Efekti matricë Janë krahasuar kurbat e kalibrimit në matricë dhe në solvent për të gjithë analitët e optimizuar. Figura 4.18 dhe 4.19 ilustrojnë kurbat për fensulfothion oxon sulfone dhe për fensulfothion oxon.

86

ME=+26 %

Figura 4.18 Efekti matricë. Figura ilustron kurbën në solvent (me të kuqe) dhe kurbën në matricë (në blu) për fensulfothion oxon sulfone në intervalin 1-10 μg/kg. Ka një efekt të lartësimit të sinjalit në matricë (ME = + 26%).

ME= -14%

Figura 4.19 Efekti matricë. Figura ilustron kurbën në solvent (me të kuqe) dhe kurbën në matricë (në blu) për fensulfothion oxon në intervalin 1-10 μg/kg. Ka një efekt shtypjeje të sinjalit në matricë (ME = -14%).

Siç mund të shihet nga grafikët e mësipërm, matrica ka tendencë për të rritur sinjalin e zbuluar (+ 26%) në rastin e fensulfothion oxon sulfone, ndërsa për fensulfothion oxon kemi shtypjen e sinjalit (-14%). Situatë të ngjashme me fensulfothion oxon u zbulua për cadusafos, disulfoton, fensulfothion, fensulfothion sulfone dhe terbufos të cilët variojnë nga 1-10 mg/kg. Për nitrofen dhe hexachlorobenzen, u demonstrua rritje e sinjalit në matricë më shumë se 30%. Ky efekt i atribuohet karakteristikave fiziko-kimike të molekulave të shqyrtuara dhe në sjellje të ndryshme që ata posedojnë në funksion të ndërveprimit me komponentët e matricës. Një nga hipotezat më të

87

besueshme për të shpjeguar këto efekte i përkasin fazës së spërkatjes (fortifikimit): matrica me komponentët e saj, ndikon në shpërbërjen e grimcave të ngarkuara në procesin e spërkatje/tharje në burim, duke shkaktuar kështu promovimin apo pengimin e jonizimit. Duke patur parasysh dallimet që gjenden në mes kurbës në matricë dhe kurbës në tretës, gjithmonë është më e përshtatshme për të aplikuar metodën aktuale duke përdorur kurbën në matricë.

4.3.4 Ripërsëritshmëria, LOD dhe LOQ Termi Saktësi nënkupton marrëveshjen ndërmjet rezultateve të testeve të pavarura, të shprehur në terma të "paqartësisë" dhe llogaritet si devijimi standard; ajo përfaqëson shkallën e marrëveshjes në mes të rezultateve të fituara nga procedura për disa herë në kushtet e dhëna. Ajo përcakton në përputhje me rrethanat edhe përsëritshmërinë e metodës, e shprehur si një përqindje e koeficientit e variacionit (CV %) ose devijimit relativ standard (RSD %) për nivele të ndryshme të fortifikimit:

ku SD (devijimi standard) përfaqëson devijimin standard dhe mesatarja e matjeve. Nga ana e saj:

Xm

)

√∑(

ku X korrespondon me vlerën e marrë për secilin sinjal dhe N – numri total i matjeve. Së fundmi janë identifikuar, kufiri i zbulimit (LOD) dhe kufiri i kuantifikimit (LOQ) për analitët e optimizuar. Tabela 4.6 tregon vlerat e LOD dhe të LOQ, rifitimet mesatare dhe devijimi standard i shprehur në përqindje për çdo analit. Duke konsideruar një numër të testeve të barabartë me 5.

88

Tabela 4.6 Vlerat e rifitimit mesatar dhe devijimi standard (RSD) i shprehur në % për tre nivelet e fortifikimit: në nivelin e LOQ, 2 x LOQ, dhe 10 x LOQ për çdo analit. Niveli i fortifikimit 10 (µg/kg)

Niveli

Niveli i fortifikimit 20 (µg/kg)

LOQ (µg/kg)

Analiti

Intervali i kalibrimit

r2

Rifitimi %

Niveli fortifikimit 100 (µg/kg)

10 LOQ (µg/kg)

2 LOQ (µg/kg)

RSD %

Rifitimi %

12

80

RSD %

i

Rifitimi RSD% %

[ng/g] Aldicarb 1.

5-1000

0.99275

82

8

80 5

5

Aldrin 2.

5-1000

0.99128

71

15

77

6

72

3

Atrazina 3.

5-1000

0.99275

89

12

90

8

91

7

Azinphos-ethyl 4.

5-1000

0.99128

72

13

77

6

82

3

Azinphos-methyl 5.

5-1000

0.99275

82

12

84

8

89

7

Azoxystrobin 6. Benomyl 7.

5-1000

0.99128

71

16

77

6

85

3

5-1000

0.97432

77

10

79

2

86

5

Bifenox8.

5-1000

0.99342

74

11

88

8

98

7

Bifenthrin 9.

5-1000

0.99129

98

15

87

16

97

13

Bitertanol 10.

5-1000

0.98265

113

13

90

11

93

10

Bromophos-methyl 11.

5-1000

0.99628

78

14

77

6

72

3

Brompropylate 12.

5-1000

0.98255

82

17

85

9

86

9

Bromuconazole 13. Buprofezin 14.

5-1000

0.99198

71

12

76

5

74

3

5-1000

0.99117

116

5

117

5

117

6

Buprofezin 15. Carbaryl 16.

5-1000

0.99273

76

10

80

9

86

8

5-1000

0.99179

82

9

76

4

78

4

Carbendazim 17. Carbofuran 18.

5-1000

0.98416

80

12

73

4

66

6

5-1000

0.99704

90

8

84

4

78

4

Chlorfenvinphos 19.

5-1000

0.99525

79

14

80

4

83

5

Chlorothalonil 20.

5-1000

0.99070

115

19

99

13

102

11

Chlorpropham 21.

5-1000

0.99655

102

13

104

12

112

12

Chlorpyrifos-methyl 22. Chlorpyriphos 23.

5-1000

0.99342

111

12

105

9

97

7

5-1000

0.99535

117

15

126

5

134

4

Cypermethrin (alpha)24.

5-1000

0.99205

85

9

88

7

88

7

Cyproconazole 25.

5-1000

0.97275

86

8

90

8

94

7

Cyprodinil 26.

5-1000

0.99676

82

16

86

12

89

9

DDD-o27. p‟

5-1000

0.99665

80

14

80

8

80

7

DDD-p28. p‟

5-1000

0.99243

90

15

98

8

101

4

DDE-o29. p„

5-1000

0.99275

90

12

96

6

98

7

DDE-p30. p‟

5-1000

0.99275

83

17

88

12

89

10

DDT-o31. p'

5-1000

0.99566

93

8

96

8

99

7

89

DDT-p32. p‟ Deltamethrin 33.

5-1000

0.99775

91

9

90

7

93

7

5-1000

0.96331

81

14

90

12

95

19

Diazinon 34.

5-1000

0.99876

87

16

88

12

90

11

Dichlofluanid 35. Dichlorobenzopheno ne-4 4' 36.

5-1000

0.99273

82

12

84

12

87

17

5-1000

0.99265

77

13

78

11

80

10

Dichlorvos 37.

5-1000

0.99275

78

11

82

10

85

9

Diclobutrazol 38.

5-1000

0.99345

89

11

92

9

94

9

Dicloran 39.

5-1000

0.99543

62

13

68

12

70

10

Dicofol40.

5-1000

0.99007

92

15

98

12

98

10

Dieldrin 41. Dimethoate 42.

5-1000

0.99034

84

11

85

10

87

8

5-1000

0.98750

79

8

75

2

69

6

Disulfoton 43.

5-1000

0.99787

87

17

83

13

87

13

Endosulfan 44. sulphate

5-1000

0.99575

76

15

75

13

80

12

Endosulfan-alpha 45.

5-1000

0.98970

72

15

78

11

80

9

Endosulfan-beta 46.

5-1000

0.99785

82

17

84

13

85

7

Endrin 47.

5-1000

0.99543

88

12

87

11

88

9

Esfenvalerate 48.

5-1000

0.99342

81

17

80

8

80

7

Ethion 49.

5-1000

0.99123

85

15

89

12

88

10

Etimfos50.

5-1000

0.98763

77

14

80

13

83

10

Etofenprox 51.

5-1000

0.99342

76

14

81

11

80

8

Fenamiphos 52.

5-1000

0.99289

87

16

80

13

87

9

Fenarimol 53.

5-1000

0.97698

92

9

98

8

98

6

Fenazaquin 54.

5-1000

0.99275

86

8

87

8

89

4

Fenchlorphos 55. Fenhexamid 56.

5-1000

0.99289

72

12

78

9

80

7

5-1000

0.99147

63

12

74

13

87

19

Fenitrothion 57.

5-1000

0.99147

72

13

104

16

103

6

Fenthion 58.

5-1000

0.99775

86

14

82

13

85

7

Fenvalerate 59. Fluopicolide 60.

5-1000

0.99274

84

15

81

11

85

5

5-1000

0.99494

92

18

93

12

105

6

Fluroxypir 61.

5-1000

0.97432

77

10

89

12

86

15

Fluvalinate-tau 62.

5-1000

0.99456

82

17

85

18

87

12

HCH-alpha 63.

5-1000

0.99475

81

17

80

11

81

8

HCH-beta 64. HCH-gamma 65. (Lindane)

5-1000

0.99885

83

10

83

9

85

7

5-1000

0.98758

82

14

78

11

80

9

Heptachlor 66.

5-1000

0.98775

78

19

80

14

83

8

Hexachlorobenzene 67.

5-1000

0.99121

92

18

88

13

99

6

Hexaconazole 68.

5-1000

0.99341

89

18

86

13

89

12

Iprodione 69.

5-1000

0.99908

94

10

92

11

93

6

Isodrin70.

5-1000

0.99373

96

12

89

10

98

9

Lambda-cyhalothrin 71. Malaoxon 72.

5-1000

0.99765

90

12

89

9

90

7

5-1000

0.99389

85

9

78

3

80

7

90

Malathion 73.

5-1000

0.99730

109

5

105

3

106

6

Metalaxyl 74. Methacrifos 75.

5-1000

0.99289

80

12

80

9

87

7

5-1000

0.99140

104

9

95

4

101

4

Methiocarb 76. Methomyl 77.

5-1000

0.99721

102

9

94

7

91

3

5-1000

0.97482

70

9

78

2

88

4

Mevinphos 78.

5-1000

0.99653

92

13

87

9

89

9

Mirex 79.

5-1000

0.97275

85

15

83

12

81

10

Myclobutanil 80. Omethoate 81.

5-1000

0.98775

72

16

80

12

88

9

5-1000

0.97504

64

11

79

3

81

7

Parathion 82.

5-1000

0.965675

92

13

94

11

98

10

Parathion-methyl 83.

5-1000

0.99702

83

14

87

15

98

17

Pendimethalin 84.

5-1000

0.98705

82

14

87

12

87

13

Permethrin 85.

5-1000

0.99775

85

11

79

10

80

8

Phorate86.

5-1000

0.97892

88

11

89

9

89

7

Phosalone 87. Pirimicarb 88.

5-1000

0.97532

89

13

87

10

83

7

5-1000

0.98502

89

12

76

6

73

5

Pirimicarb 89. desmethyl

5-1000

0.98114

105

21

85

14

93

15

Pirimiphos-methyl 90.

5-1000

0.98789

82

12

80

8

84

7

Procymidone 91. Profenofos 92.

5-1000

0.99267

87

16

88

12

89

9

5-1000

0.99421

112

7

109

4

111

5

Propamocarb 93.

5-1000

0.99203

72

16

84

8

89

5

Propiconazole 94. Propoxur 95.

5-1000

0.99545

94

12

97

9

980

8

5-1000

0.99619

89

7

86

5

80

5

Propyzamide 96.

5-1000

0.99234

106

8

99

8

99

7

Prothiophos 97. Pyrimethalin 98.

5-1000

0.99754

112

7

102

8

104

7

5-1000

0.98938

87

9

84

4

83

4

Quinalphos 99. Quinoxifen 100.

5-1000

0.98973

89

7

97

8

99

7

5-1000

0.98337

180

36

150

18

137

27

Quintozene 101.

5-1000

0.99275

98

9

99

8

111

7

Sulfotep 102.

5-1000

0.98997

86

13

88

9

89

8

Tebufenpirad 103.

5-1000

0.99554

87

15

89

12

97

9

Tecnazene 104. Terbufos 105.

5-1000

0.99788

78

15

80

9

88

7

5-1000

0.99395

115

9

113

4

115

5

Terbufos 106.

5-1000

0.99443

72

18

77

11

80

9

Tetradifon 107. Thiabendazolo 108.

5-1000

0.99233

82

19

80

8

80

7

5-1000

0.99056

73

10

73

4

88

7

Thiocarb 109.

5-1000

0.98620

84

11

79

5

72

6

Thiofanate 110. methyl

5-1000

0.99390

78

10

73

6

71

7

Tolylfluanid 111. Transheptachlor epoxide112.

5-1000

0.99275

101

12

98

10

88

8

5-1000

0.99887

97

10

94

9

86

8

Triadimefon 113.

5-1000

0.99966

108

7

97

6

95

4

91

Triadimefon 114.

5-1000

0.99656

86

10

84

8

82

6

Triadmenol 115.

5-1000

0.98765

89

17

83

18

80

17

Trifluralin 116.

5-1000

0.99234

92

14

87

9

84

8

Vinclozolin 117.

5-1000

0.99676

87

17

84

12

80

7

4.3.5 Specificiteti Lloje të ndryshme të matricave nuk kanë zbuluar sinjale me vlera më të mëdha se 3:1 në kohën e mbajtjes (RT) së analitit. Të gjitha sinjalet ishin nën 30% të LOQ përcaktuar për secilin prej tyre. Tabela 4.7 Rezultatet mesatare të parametrave të metodës.

Cfarë?

SA DUHET?

REZULTATET

Lineariteti

R2 ≥ 0.995

R2 = 0.998

LOD

0.01 mg/kg

0.005 mg/kg

LOQ

0.01 mg/kg

0.01 mg/kg

Ripërsëritshmëria

RSD ≤ 20 %

≤ 20 %

Rifitimi

70 – 120 %

86.14 % (mesatare)

Sic shihet nga tabela, mund të konkludojmë se parametrat e kërkuara për vlefshmërinë e metodës janë plotësuar për analitët e optimizuar.

4.4 KRAHASIMI NDËRMJET TRE METODAVE. Numri i faktorëve që duhet të merren në konsideratë për përzgjedhjen e metodës për analizën e mbetjeve të pesticideve është i madh. Ndër to mund të përmendim së pari qëllimin e analizimit: në qoftë se është për një pesticid individual, një klasë kimike e pesticideve, një numër i madh i pesticideve të klasave të ndryshme kimike, apo edhe për përfshirjen e produkteve të tyre të transformimit. Faktorë të tjerë përfshijnë karakterisitikat fiziko-kimike dhe molekulare për secilin pesticid, ku përfshihen: pika e vlimit; polariteti; tretshmëria në tretësin e dëshiruar ose fazën e lëvizshme; stabiliteti i tyre në portën e injektimit, në kolonë, apo në burimin e joneve të mas-spektromatësit; selektiviteti i kolonave dhe sjellja kromatografike e tyre; interferencat në identifikim; struktura molekulare ose veti të tjera kimike të rëndësishme për procesin e jonizmit dhe fragmentimit; kufiri i detektimit të metodës ose kërkesat rregullatore për nivelet e lejuara; dhe aftësia konfirmuese e metodës (Raina, 2011).

92

Rezultatet e vlerësimit treguan që të treja metodat e ekstraktimit (metoda Kadenczky, metoda me etil acetat dhe metoda QuEChERS) plotësojnë të gjithë parametrat e performancës të nevojshme për të analizuar mbetjet e pesticideve në matricat me origjinë bimore. Matricat me origjinë bimore janë të shumëllojshme, ashtu sikurse edhe pesticidet me të cilat ato trajtohen gjatë kultivimit të tyre, kanë natyra kimike të shumëllojshme, si e tillë puna e analistit të mbetjeve të pesticideve fillon me zgjedhjen e metodës analitike. Metoda e tij duhet të ketë aftësi të detektojë një numër sa më të madh të analitëve (pesticideve) pasi për kampionet e marra në tregun ushqimor për qëllim të sigurisë ushqimore nuk dihet asnjë histori trajtimi dhe për të analizuar ato duhet të hetosh për një rang të gjerë analitësh. Të treja metodat e përdorura në këtë studim janë të vlefshme për analizimin e mbetjeve të pesticideve në matricat me origjinë bimore. Ndryshimi ndërmjet tyre qëndron në: teknikën kromatografike të përdorur kohën e analizës koston e analizës. Në tabelën e mëposhtme (tabela 4.8) janë vënë në mënyrë krahasuese metodat në funksion të faktorëve cilësorë të mësipërm. Tabela 4.8 Krahasimi i metodave analitike në funksion të faktorëve cilësorë të tyre. Metoda Kadenczky

Metoda SweEt

Pajisjet instrumentale (konfigurimi i tyre)

GC-ECD/FID/FTD, HPLC-UV

Numri i analitëve (pesticideve)

Numri i analitëve është i kufizuar pasi ientifikimi bëhet mbi kohën e mbajtjes së analitit.

GCECD/FID/FTD, HPLC-UV Numri i analitëve është i kufizuar pasi identifikimi bëhet mbi kohën e mbajtjes së analitit.

Koha e ekstraktimit për një kampion.

~3 orë

~90 min

Metoda QuEChERS LCMS/MS GCMS/MS Më shumë se 100 analitë në të njëjtën kohë

~30 min

Për sa më sipër mund të themi që Metoda Kadenczky mund të përdoret për analizimin e mbetjeve të pesticideve në matricat e fruta-perimeve, por disavantazhet e përdorimit të kësaj metode fillojnë me: (i) numri i analitëve (pesticideve) që mund të analizohen në të njëjtën kohë me anë të kësaj metode është i kufizuar, pasi identifikimi i analitëve bëhet mbi bazën e kohës së mbajtjes së analitit në kolonën kromatografike duke e krahasuar me standardin përkatës;(ii)

93

identifikimi vetëm me anë të kohës së mbajtjes nuk është konfirmator; (iii) koha e analizës është shumë e gjatë nëse kjo metodë përdoret për qëllime të kontrollit zyrtar të ushqimeve; (iv) kosto për një analizë është e lartë duke konsideruar që numri i analizave të nevojshme për një mostër është minimumi shtatë (SANCO/12571/2013, 2013). Pra metoda Kadenczky është konsideruar si një risi në kohën që ajo u zbulua kolona ekstraktuese përfshinte dy hapat: ekstraktim dhe purifikim dhe ajo u përdor dhe mundet akoma të përdoret me sukses për qëllime studimore/kërkimore (Cara 2007) por nuk është e përshtatshme për përdorim rutinë në ditët e sotme për shkak të metodave më efikase të kontrollit të mbetjeve të pesticideve. Metoda e ekstraktimit me etil acetat (SweEt) e përdorur në këtë studim ështe e njëjtë me metodën Kadenczky në aspektin e teknikës kromatografike të përdorur. Siç e pamë ekstrakti i filtruar injektohet në GC/ECD/FTD dhe HPLC-UV për të cilat vlen e njëjta problematikë si për metodën Kadenczky. Pra kjo metodë mund të përdoret për qëllime studimore/kërkimore por nuk është e përshtatshme për përdorim në analizat rutinë të kontrollit të mbetjeve të pesticideve. Autorët e kësaj metode tashmë kanë vlerësuar dhe miratuar variantin e thjeshtëzuar të saj duke reduktuar kohën e analizës në 30 min. Dhe duke zëvendësuar teknikën e thjeshtë gazkromatografike me atë të detektimit me anë të spektrometrisë së masës (GC-MS/MS dhe LC-MS/MS). Kjo metodë (varianti i reduktuar), duhet vlerësuar dhe konfirmuar nëse ajo është e përshtatshme për tu përdorur në laboratorët tanë për qëllime si kërkimore ashtu edhe të kontrollit rutinë. Metoda QuEChERS e zhvilluar në punën e tanishme është e përshtatshme për përcaktimin e mbetjeve të pesticideve (114 analitë) në produkte me origjinë bimore. Pikat e forta të metodës së zhvilluar qëndrojnë në thjeshtësinë dhe shpejtësinë e ekzekutimit të fazës së ekstraktimit dhe pastrimit të mostrës, numri i lartë i analitëve të përcaktuar dhe besueshmërinë e teknikave të analizës instrumentale të miratuara, në bazë të spektrometrisë së masës. Duke patur parasysh evoluimin e vazhdueshëm në përdorimin e pesticideve që përdoren në bujqësi, është e lehtë për të kuptuar rëndësinë e të pasurit në dispozicion metoda të analizës së shumë mbetjeve të zbatueshme për një gamë të gjerë të substancave me karakteristika të ndryshme kimike-fizike në drejtim të polaritetit, paqëndrueshmërisë dhe fortësisë (Scientific Report Of EFSA, 2013). Në këtë kontekst, zbatimi i teknikave kromatografike shoqëruar me spektrometrinë në masë tani ka marrë një rol kyç në përcaktimin e mbetjeve të pesticideve në ushqim për konsum njerëzor, siç u dëshmua nga kriteret e performancës së metodave analitike aplikuar për këtë qëllim.

94

Teknikat GC/MS, GC-MS/MS, LC- MS /MS, dhe në disa raste LC/ MS janë të nevojshme për të mbuluar gamën e plotë të klasave kimike të pesticideve dhe produktet e tyre të transformimit. Asnjë metodë nuk mund të plotësojë nevojat e të gjitha klasave kimike të pesticideve të tanishme.

4.5 REZULTATET MBI VLERËSIMIN E MBETJEVE DHE DEGRADIMIN E ACETAMIPRIDIT NË SPEC Më poshtë janë paraqitur Kromatogramat përfaqësuese për: (a) mostrën e bardhë, (b) standardin acetamiprid, (c) lëndën aktive acetamiprid në mostër:

6.0

uV(x1,000,000) Chromatogram

5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

min

17.5

20.0

min

Figura 4.20 Kromatograma për mostrën e bardhë spec

RT7.380

uV(x100,000) 2.00 Chromatogram 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

Figura 4.21 Kromatograma për standardin acetamiprid uV(x10,000) 5.0 Chromatogram 4.0

acetamiprid

3.0

2.0

1.0

0.0 2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

Figura 4.22 Kromatograma për acetamiprid në mostër (spec)

95

20.0

min

Tabela 4.9 Shkalla e zbërthimit të acetamipridit në dozën minimale Mbetjet e ekstraktuara në mg/kg

Data e marrjes së mostrave

Ditë pas trajtimit

Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012 Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012 Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012 Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012 Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012

Viti I

Viti II

Viti III

Mesatare

0.74 1

0.61

0.67 0.72

0.49 3

0.38

0.45 0.45

0.27 5

0.28

0.30 0.34

0.19 7

0.21

0.21 0.24

0.11 9

0.09

0.10 0.10

Zbërthimi i acetamipridit - doza minimale 0,8 Përqëndrimi mg/kg

0,7

0,67

0,6 0,5

0,45

0,4 0,3

0,3 0,21

0,2 0,1

0,1

0 1

2

5

7

9

Ditët pas trajtimit

Grafiku 4.1 Zbërthimi i acetamipridit - përqëndrimi 20g/L

Nga grafiku i degradimit shohim që pas trajtimit me dozën minimale të rekomanduar produkti arrin vlerën e nivelit maksimal të lejuar të acetamipridit që në ditën e pestë pas trajtimit. Vlera maksimale e lejuar për acetamipridin në spec është 0.3 mg/kg (Ref: EU pesticide database)

96

Tabela 4.10 Shkalla e zbërthimit të acetamipridit në dozën maksimale Data e marrjes së mostrave

Mbetjet e ekstraktuara në mg/kg (përqëndrimi 40g/L)

Ditë pas trajtimit Viti I

Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012 Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012 Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012 Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012 Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012

Viti II

Viti III

Mesatare

1.34 1

1.41

1.4 1.62

0.99 3

1.18

1.05 0.94

0.87 5

0.84

0.82 0.76

0.59 7

0.41

0.59 0.66

0.31 0.28 9

0.31 0.33

Zbërthimi i acetamipridit - doza maksimale 1,6 Përqëndrimi mg/kg

1,4

1,4

1,2 1,05

1

0,82

0,8 0,6

0,59 0.31

0,4 0,2 0 1

2

5

7

9

Ditët pas trajtimit

Grafiku 4.2 Zbërthimi i acetamipridit -përqëndrimi 40g/L

Nga grafiku i degradimit shohim që pas trajtimit me dozën maksimale të rekomanduar produkti arrin vlerën e nivelit maksimal të lejuar të acetamipridit në ditën e nëntë pas trajtimit. Vlera maksimale e lejuar për acetamipridin në spec është 0.3 mg/kg (Ref: EU pesticide database).

97

4.6 KONKLUZIONE MBI DEGRADIMIN E ACETAMIPRIDIT NË SPEC Zbërthimi i acetamipridit në spec për të dy dozat e trajtimit dhe krahasimi me MRL-në është paraqitur në grafikun e mëposhtwm: Zbërthimi i acetamipridit për të dy dozat dhe krahasimi me MRL-në Doza max; 1; 1,4

Doza max Doza min

1,05

PHI 0,82 0,67 0,59

NML=0.3

0,45

0.31 0,3 0,21 0,1

Grafiku 4.3 Zbërthimi i acetamipridit në spec për të dy dozat e trajtimit dhe krahasimi me NML-në

Në serrat diellore me plastmas, për luftimin e krahëbardhës mund të përdoret acetamiprid me dozën 20g/L sepse insekticidi zbërthehet brenda 5 ditëve dhe lejon vjeljen e shpejtë dhe tregtimin e specit. Trajtimi me dozën 40 g/L në këto tipe serrash, zbërthimi i acetamipridit kërkon kohëzgjatje më të madhe se 7 ditë të PHI dhe për këtë do të rekomandonim një alternativë insekticidi me karencë më të ulët. Nëse duhet të përdoret kjo dozë fermeri duhet të respektojë kohën e degradimit të pesticidit, që në këtë rast është 9 ditë kalendarike.

4.7 REZULTATET MBI VLERËSIMIN E MBETJEVE TË IMIDAKLOPRIDIT NË DOMATE. Më poshtë janë paraqitur Kromatogramat përfaqësuese për, a) standardin imidakloprid, b) kromatograma për mostrën e bardhë, c) kromatograma për imidakloprid në domate.

98

/1.902

mAU 210nm,4nm (1.00) 200

150

100

50

0

0.0

2.5

5.0

7.5

min

Figura 4.23 Kromatograma për standardin imidakloprid. 6.0

uV(x1,000,000) Chromatogram

5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

min

mAU 210nm4nm (1.00)

2.5

/1.482

5.0

/2.714

7.5

Imidacloprid/1.927

10.0

/2.307

Figura 4.24 Kromatograma për mostrën e bardhë (domate)

0.0

0.0

2.5

5.0

7.5

Figura 4.25 Kromatograma për imidakloprid në mostër (domate).

99

min

4.7.1 Ecuria e degradimit të imidaklopridit në domate Tabela 4.11 Shkalla e zbërthimit të imidaklopridit në dozën minimale Data e marrjes së mostrave

Mbetjet e ekstraktuara në mg/kg përqëndrimi 25g/L

Ditë pas trajtimit Viti I

Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012 Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012 Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012 Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012 Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012

Viti II

Viti III

Mesatare

1.01 1

1.21

1.1 1.12

0.82 3

0.78

0.81 0.84

0.65 5

0.64

0.63 0.6

0.49 7

0.41

0.42 0.36

0.19 0.23

0.21

9

0.21

1,2 Përqëndrimi në mg/kg

1,1 1 0,81

0,8 0,6

0,53 0,42

0,4

0,21

0,2 0 1

3 Ditët e marrjes 5 së mostrave 7

9

Grafiku 4.4 Ecuria e degradimit të imidaklopridit në domate ((përqëndrimi 25g/L)

Nga grafiku i degradimit shohim që pas trajtimit me dozën minimale të rekomanduar produkti arrin vlerën e nivelit maksimal të lejuar të midaklopridit që në ditën e pestë pas trajtimit. Vlera maksimale e lejuar për imidakloprid në domate është 0.5 mg/kg (Ref: EU pesticide database).

100

Tabela 4.12 Shkalla e zbërthimit të imidaklopridit në dozën maksimale Data e marrjes së mostrave

Mbetjet e ekstraktuara në mg/kg ( përqëndrimin 50g/L)

Ditë pas trajtimit Viti I

Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012 Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012 Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012 Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012 Qershor 2010 Qershor 2011 Maj 2012

Viti II

Viti III

Mesatare

1.34 1

1.41

2.11 1.62

0.99 3

1.18

1.55 0.94

0.87 5

0.84

1.13 0.76

0.59 7

0.41

0.63 0.66

0.31 0.28

0.45

9

0.33

Përqëndrimi në mg/kg

2,5 2

2,11

1,56

1,5

1,13

1

0,63

0,5

0,45

0 1

3

5

7

9

Ditët e marrjes së mostrave

Grafiku 4.4 Ecuria e degradimit të imidaklopridit në domate (përqëndrimi 50g/L)

Nga grafiku i degradimit shohim që pas trajtimit me dozën maksimale të rekomanduar produkti arrin vlerën e nivelit maksimal të lejuar të imidaklopridit në ditën e nëntë pas trajtimit. Vlera maksimale e lejuar për imidakloprid në domate është 0.5 mg/kg (Ref: EU pesticide database).

101

Konkluzione mbi degradimin e imidaklopridit në domate Zbërthimi i imidaklopridit në domate për të dy dozat e trajtimit dhe krahasimi me NML-në.

Grafiku 4.5 Zbërthimi i imidaklopridit në domate për të dy dozat e trajtimit dhe krahasimi me NML-në

Zbërthimi i imidaklopridit për të dy dozat e trajtimit dhe krahasimi me NML

2,11

1,56

1

3

Doza min.

PHI 7

5

9

1,13

1,1

Doza max.

NML=0.5 0.63

0,81 0,45

0,63 0,42

0,21

Në serrat diellore me plastmas, për luftimin e insekteve mund të përdoret imidakloprid me dozën 20 g/L sepse insekticidi zbërthehet brenda 5 ditëve dhe lejon vjeljen e shpejtë dhe tregtimin e specit Trajtimi me dozën 40 g/L në këto tipe serrash, zbërthimi i imidaklopridit kërkon kohëzgjatje më të madhe se 7 ditë të PHI dhe për këtë do të rekomandonim një alternativë insekticidi me karencë më të ulët. Nëse duhet të përdoret kjo dozë fermeri duhet të respektojë kohën e degradimit të pesticidit, që në këtë rast është 9 ditë kalendarike.

102

4.8 REZULTATET E MBETJEVE TË PESTICIDEVE NË PARCELËN EKSPERIMENTALE Në skemën e mëposhtme jepet përmbajtja e mbetjeve të pesticideve sipas parcelave përkatëse të serrës eksperimentale. Ashtu siç e kemi përmendur më lart (materiali dhe metoda) serrat u trajtuan me klorpyrifos për qëllime të kultivimit nga fermeri, dhe nga analizat e kryera për secilën parcel rezultoi që përveç pesticidit klorpyrifos në dy parcela të serrave u identifikuan edhe gjurmë të dieldrinës (sasi më e vogël se 10 µg/kg)

1 Pa mbetje të pesticideve.

2 Gjurmë të:dieldrinës klorpyrifos

3 Gjurmë të:dieldrinës klorpyrifos

6 Pa mbetje të pesticideve

5 klorpyrifos

4 klorpyrifos

Tabela 4.13 Përmbajtja e klorpyrifos-it sipas parcelave dhe shkalla e shpërbërjes sipas javëve.

Parcela Nr 1

Mbetjet e klorpyrifos (mg/kg) java 2 java 3 java 4 nd nd nd

2 3 4 5 6 Shënim: nd –nuk u detektua

Java 6 nd

114

23

nd

nd

37 63 98 nd

nd 5 5 nd

nd nd nd nd

nd nd nd nd

Pas javës së katërt në tokë nuk u dedektua klorpyrifos dhe si e tillë nuk ka ndikim në prodhimin në vijim.

103

Figura 4.26. Kromatograma totale dhe spektri i masës për dy pesticidet e identifikuara në mostrat e tokës.

104

PËRFUNDIME Metodat e përdorura në këtë studim janë të vlefshme për analizimin e mbetjeve të pesticideve në matricat me origjinë bimore. Por metoda Quechers. është metoda më e thjeshtë, më e shpejtë në fazën e ekstraktimit të mostrës, me numrin më të madh të analitëve të përcaktuar në të njëjtën kohë, besueshmërinë më të lartë dhe njëkohësisht me koston më të ulët krahasuar me dy metodat e tjera. Gjatë studimit të degradimit të acetamipridit në spec dhe imidaklopridit në domate u vu re që, në trajtimin me dozën maksimale të rekomanduar koha e intervalit të paravjeljes (karenca) është më e madhe se 7 ditë të rekomaduara. Për këtë arsye do të rekomandonim që në periudhën e vjeljes së produkteve trajtimi të bëhet vetëm me dozën minimale (karenca ~ 5 ditë), ose të aplikohen alternativa të tjera trajtimi me karencë më të ulët. Laboratorët tanë janë në gjendje të vlerësojnë metodat analitike më të përdorura dhe të rekomanduara nga BE për mbetjet e pesticideve. Padyshim duhet të synohet në përmirësimin e performancës së teknikave analitike në dispozicion sot, si dhe në zgjerimin e mëtejshëm të gamës së substancave të analizuara për të siguruar nivele më të larta të mbrojtjes për shëndetin e njeriut.

105

CHAPTER V. SUMMARY Fresh products safety is a global issue that covers at the same time countries that import fresh fruits and vegetables and countries that export them. Given the role of fresh produce in a healthy diet, it is important that these foods should be extremely safe. On the one hand people are encouraged to consume more vegetables and fruits, these being a good source of vitamins and fiber and also beneficial to their health - and on the other hand, the mass media have rightly created an awareness about, but wrongly magnified the environmental and health problems and the risk involved in the use of chemicals, especially pesticides, in agriculture. Consequently, this has created a certain apprehension and fear in the public as to the presence of pesticide residues in their daily food. The public is confused and alarmed about food safety. Analysis of pesticide residues is a priority, especially in terms of consumer protection. For this purpose should be available quick, accurate and low cost methods to allow their monitoring. Control of pesticide residues in food products includes a large number of samples. The cost of reagents and the time consumed for analysis constitutes the largest part of the total cost of their monitoring. The first part of this study, describes the development and evaluation of pesticide residue analysis methods, aiming at a quick, low cost and reliable results. There are a large number of factors that require consideration for the selection of the analysis method, whether that is for an individual pesticide, a chemical class of pesticides, a large number of pesticides of different chemical classes, or for inclusion of their transformation products. These factors include: boiling point or polarity; solubility in desired solvent or mobile phases; stability of pesticides in injector ports, on-column, or in mass spectrometer ion sources; selectivity of columns and chromatographic behavior; interferences in detection; molecular structure or other chemical properties important for both ionization and fragmentation; method detection limit or regulatory requirements; and confirmation ability over linear dynamic range (Raina, 2011). Validation results showed that all three methods of extraction (Kadenczky methods, methods with ethyl acetate -SweEt and QuEChERS method) meet all performance parameters needed to analyze pesticides in matrices of plant

106

origin. The easy method, cheap, quick, safe and also covers a large number of pesticides at the same time, is the QuEChERS method. Given the continued evolution of pesticides used in agriculture, it is easy to understand the importance of having available multiresidue methods of analysis applicable to a wide range of substances with different physical and chemical characteristics in terms of polarity, volatility and stability. In this context, the application of chromatographic techniques coupled with mass spectrometry now has taken a key role in the determination of pesticide residues in food for human consumption. Calculations and statistical processing are performed based on programs certified by accredited laboratories according to the standard ISO / IEC 17025: 2005. In the second part are presented the results of experiments conducted during the study, including: Analysis and determination of residues of Imidacloprid in tomato. Analysis and determination of residues of Acetamiprid in peppers. The degradation rate of these pesticides in treatment with two recommended doses (minimum and maximum) and their comparison with the maximum level of residues referred to European standards MR's. Study of the degradation of pesticides after using two treatment recommended doses serves to the farmers to know the best harvest time of the final product, hereby respecting legislation on maximum permitted levels of residues and consumer safety.

5.2 REVIEW OF LITERATURE Imidacloprid and acetamiprid are neonicotinoid insecticides from the chloronicotinyl nitroguanidine chemical family. The International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) name is 1-(6-chloro-3-pyridylmethyl)N-nitroimidazolidin-2-ylideneamine and the Chemical Abstracts Service (CAS) registry number is 138261-41-3. According to technical datasheet; they are used to control sucking insects, some chewing insects including termites, soil insects, and fleas on pets. In addition to its topical use on pets, imidacloprid and acetamiprid may be applied to structures, crops, soil, and as a seed treatment.

107

5.3 PURPOSE OF THE RESEARCH In our country there is not yet a tradition in the study of pesticide residues in products of plant origin. Studies on pesticides have been only in the frame of research for qualification purposes at different levels. The methods used for those purposes are the classical methods of extraction, purification and determination. These methods are very long in time, have low efficiency (number of pesticides analyzed is very limited), so there are not suitable for the purpose of the pesticide residue control in food of plant origin in the food safety context. Therefore in this study will ponder on the development and evaluation of methods that are intended to help solving this problem somehow. Availability of analytical methods to analyze simultaneously a large number of pesticides poses significant scientific and practical contribution Application of these methods in researching and assessing the level of residues of insecticides in plant organs, increases the importance of the study, and professional practice will propose the necessary information on the time of harvest products in accordance with the dose of treatment. Judging by what was said above, to achieve this goal are taken the following objectives: Laboratory (in house) validation of methods of analyzing pesticide residues: Kadenzcky, SweEt and QuEChERS methods. The comparison between them. Study the degradation of insecticide Acetamiprid in pepper, to assess the right time for his collection and recommending the most appropriate dose for use in accordance with pre harvest interval (PHI) and recommended MRL. Study the degradation of insecticide Imidacloprid in tomato, to assess the right time for his collection and recommending the most appropriate dose for use in accordance with pre harvest interval (PHI) and recommended MRL Study the level of the pesticide residues in greenhouses treated soil.

5.4 MATERIAL AND METHOD 3.1 Location of the experiment The study was conducted in two types of vegetable; tomato and pepper which are widely cultivated in greenhouses. Experiments are set up in "Hysni Gjergji" greenhouse at Rada, Durres. Planted greenhouse with tomatoes (230 m2) Planted greenhouse with peppers (350 m2)

108

3.3 The experimental plan for designing the evaluation of the level of residues of imidacloprid in tomatoes Experimental design inside the tomatoes greenhouse: V1 – First line. It is not treated. V2 – Second line, it is treated with minimal dose of 0.025 %. V3 – Third line, it is treated with maximal dose of 0.05 %. For every line are treated 30 plants and within the line are left some buffer areas. Greenhouse it is Izraelit type, with ventilation and heating. Crops planted: tomato and pepper Treatments are done by professional sprayer from Plant Protection Laboratory in Durres.Albania Sampling started every time 1 day after treatment and continued every two days until the day of PHI and two days after PHI.

5.4.1 Kadenczky method 5 g sample + 10 g florisil homogenised in porcelain mortar Filling the column chromatography Fiberglass + 10g Na2SO4

Eluate with 50 ml etilacetat + acetone (1: 5) Concentration of the extract in vacuum rotavapor

Picture 5.1 Preparation of samples for analysis

Analysing in the GC or LC

Figure 5.2. Flow scheme of Kadenczky analytical method.

109

5.4.2 Ethyl acetate (SweEt) method The Swedish National Food Administration has since 1989 employed a multi residue method that is based on extraction with ethyl acetate followed by LC and GC determination1. The multi residue method has been revised continuously resulting in an improved and simplified methodology for analysis of pesticides residues Application area/matrices The method is used for analysis of pesticide residues in fruit and vegetables by means of LCMS/MS and GC-MS/MS detection and has been validated according to SANCO 10684/20092 for three selected commodity groups (see Annex 1) 1) high water content. 2) high acid content and high water content and 3) high sugar and low water content. Principles Residues are extracted from food matrix with ethyl acetate. Sodium hydrogen carbonate is added to well homogenised crop sample which is extracted with ethyl acetate. After centrifugation and filtration the extract is injected to GC-MS/MS and LC-MS/MS. No clean up is needed Extraction 10 g sample + 3 g NaHCO3 10 g Na2SO4 and 20 ml ethyl acetate Falcon tube in ultrasonic bath 3 minutes ↓ Centrifugation in 3 min, (3200 g) ↓ Filtration Filtrate the crude extract 0.20 μm PTFE filter ↓ Inject to GC and HPLC Sample conc. 0.5g/ml Figure 5.3 The analytical flow scheme of the ethyl acetate method

5.4.3 Quechers Method (UNI EN 15662: 2009) Pesticide residue analysis in food is one of the most important and challenging tasks in routine laboratory practice. The European legislation, which is currently the most strict legislation (European Regulation 396/2005 and Commission Directive 2006/125/EC), sets maximum residue limits (MRL) of pesticides in different products of plant and animal origin. This presents a

110

significant analytical challenge with respect to the low limits of quantification (LOQ) required for some specified food matrices. A variety of GC and HPLC methods have been developed for multi-residue determination of pesticides employing a variety of sample preparation and cleanup techniques. In recent years the QuEChERS method has become widely adopted for preparing samples of fruit and vegetables, but the continuous need for more sensitive and accurate measurements requires new developments from the instrument producers as well. This method reports on in-house validation results and assessment of performance parameters of a complete multi-residue pesticide analysis method employing QuEChERS sample preparation kits.. Homogenization Sample + IS Weigh 10 g sample in 50 mL extraction tube and 200 μL stock IS Extraction Add 9.8 mL acetonitrile Shake for 10 min, centrifuge at 3500 rpm for 5 min Clean up Transfer supernatant into a 15 mL clean-up tube Centrifuge samples at 3500 rpm for 5 min Transfer supernatant into a LC vial GC/LC-MS/MS ANALYSIS Figure 5.4 The analytical flow scheme of QuEChERS method

5.5 . Method Performance Characteristics In-house validation of the method was carried out on all matrices and target pesticides. European guidelines for single laboratory validation and pesticide residue analysis were used for establishing method performance criteria. All method performance parameters were compared to the relevant legislative requirements and maximum residue limit (MRLs). (EC396/2005). For compounds containing more isoforms, only one performance criteria was established.

111

5.5.1 Selectivity Method (MRM) selectivity was assessed based on the presence of specific ion transitions (quantifier ion and two transitions for compound confirmation) at the corresponding retention time, as well as the observed ion ratio values corresponding to those of the standards. Acceptance criteria for retention time and ion ratios were set according to current quality control Criteria. Matrix blank samples were also inspected for the presence of interfering peaks in close vicinity of the target retention times for which (according to SANCO guideline definitions) <30% of LOQ acceptance criteria was applied.

5.5.2 Linearity, Response Factor, Matrix Effect The calibration curves were created at six levels (matrixmatched) and injected in duplicate. Rf values for internal standardization were determined from the calibration curves for all matrices and internal standards by calculating cumulative average response factor over the whole calibration range. The linearity of calibration curves was assessed in calibration ranges of 0–500 ng/g. Calibration levels were equidistantly distributed over the calibration range. Linear function was evaluated according to Mandel‟s fitting test and plotting of residuals for which <20% acceptance limit was set. Correlation coefficient values were additionally established for which an artificial 0.985 was set as an acceptance limit, as no legislative limits are defined for them. The set value wasn‟t met for Benomyl, Deltamethrine, Methomyl and Fluroxypir based on the high LOQ values related to the calibration levels. No weighted function was applied. Matrix effects were evaluated by (Youden-) plotting of measured relative peak areas of calibration standards in solvent against the areas in the relevant matrix [6]. No matrix effect is observed if the difference of the slope (dif%) of the fitted line is less than 20% from the ideal (y=x) curve, while matrix effects are observed when the difference is between 20–50% (minor matrix effect) or exceeds 50% (major matrix effect).

5.5.3 Accuracy Method trueness was assessed by recovery studies using blank matrices spiked at three concentration levels (L1, L2 and L3) and injected in six individually prepared replicates. Spiking of samples occurred prior to sample preparation. Found concentrations, recovery and relative standard deviation (% RSD) were calculated According to SANCO requirements recovery values are deemed acceptable if between 70–120%.

112

5.5.4 (Intermediate) Precision Instrument injection precision was tested for both retention time and peak area for all target compounds by subsequent injections (n=6) of three concentration levels ; concentration level (L1= 10 ng/g), (L2= 20 ng/g), (L3= 100 ng/g) standard solutions. Instrument injection precision for retention time was below 0.5% for all compounds for peak area without internal standard compensation indicating reliable instrument performance. Method within-day and between-day precision values were determined for each matrix at middle spiking level (L2) and expressed as %RSD over 3 days with individually prepared samples (n=6). Mean within-day precision values were determined as an average of the 3 individual days‟ mean precision, while between-day precision was expressed as mean of the overall precision data. According to SANCO requirements <20% was set as acceptance criteria for the target compounds and matrices

5.5.5 Limit of Detection, Limit of Quantification Limits of detection and quantification were estimated following the IUPAC. An artificial MRL=10 ng/g was set as target value for compounds, for which no MRL values are legislatively defined. The expectation of the method was to meet MRL values at least at LOQ level which was achieved for the all target compounds.

5.6 RESULTS AND DISCUSSION 5.6.1 Results of method validation. Number of factors to be taken into consideration for the selection of the method of analysis is large. Among them we can mention: if it is for an individual pesticide, a chemical class of pesticides, a large number of different pesticide chemical classes, or for the inclusion of their products of transformation. These factors include: boiling point or polarity; solubility in the desired solvent or mobile phase; stability of pesticides in the injection gate, the column, or the source of ions into the mass spectrometer; selectivity of chromatographic columns and their behavior; interference in identification; molecular structure or other chemical properties important for the process of ionization and fragmentation; The detection limit of the method or regulatory requirements for permitted levels; and the confirmatory ability of the method (Raina, 2011). Evaluation results showed that all three methods of extraction (method Kadenczky, SWEET methods and methods QuEChERS) meet all performance

113

parameters needed to analyze pesticides in matrices of plant origin. Matrices of plant origin are diverse, as well as pesticides with which they are treated during their cultivation, have diverse chemical nature, such as the work of pesticide residues analyst begins with the choice of analytical method. His method must have the ability to detect a greater number of pesticides because the samples obtained in the food market for food safety purpose has no known treatment history and to analyze them seek out for a range of wide substances. . The three methods used in this study are valuable for analyzing pesticide residues in matrices of plant origin. The difference between them lies in chromatographic technique used, the time of analysis and cost analysis. Kadenczky method can be used for the analysis of pesticide residues in fruit and vegetable matrices, but the disadvantages of using this method start with: (i) the number of pesticides that can be analyzed at the same time by this method is smaller, because the identification of substances is made on the basis of the period of the analyte in the column chromatography by comparing with the relevant standard; (ii) identification only through retention time is not confirmatory; (iii) the analysis time is too long if this method is used for the purposes of official control of food; (iv) analysis cost is higher analysis considering the number of tests required for a sample is the minimum seven (SANCO / 12571/2013, 2013). So Kadenczky method is considered as a novelty at the time it was discovered extraction columns included two steps: extraction and purification, and it was used and can still be used successfully for study / research (Cara M, 2007) but it is not appropriate for routine analysis, because of more efficient methods to control pesticide residues. Etilacetat extraction method (SWEET) used in this study is similar to the method Kadenczky in terms of chromatographic technique used. As we saw filtered extract injected into the GC / -ECD / FTD and HPLC-UV to be worth the same weaknesses as Kadenczky method. So this method can be used for study / research but is not suitable for use in routine analysis of pesticide residues control. The authors of this method have already adapted its simplified version by reducing the analysis time to 30 min. And simply replacing Gas chromatographic technique with detection by mass spectrometry (GC-MS / MS and LC-MS / MS). This method (reduced version), should be evaluated and confirm whether it is suitable for use in our laboratories for research purposes as well as routine control. QuEChERS method developed in the present study was suitable for the determination of pesticide residues (114 substances) in products of plant origin. Strengths of the method developed lie in the simplicity and speed of execution phase extraction and purification of the sample, the high number of pesticides

114

determined and reliability of instrumental analysis techniques adopted, based on mass spectrometry. Given the continued evolution in the use of pesticides used in agriculture, it is easy to understand the importance of having available methods of analysis applicable to a wide range of substances with different chemical-physical terms of polarity, volatility and strength (Scientific Report of EFSA, 2013). In this context, the application of chromatographic techniques coupled with mass spectrometry now has taken a key role in the determination of pesticide residues in food for human consumption, as demonstrated by the performance criteria of analytical methods applied for this purpose. Methods GC / MS, GC-MS / MS, LC- MS / MS, and in some cases LC / MS are required to cover the full range of chemical classes of pesticides and their transformation products. No method can meet the needs of all classes of the current chemical pesticides.

5.7 CONCLUSIONS The methods used in this study are available for the analysis of pesticide residues in plant matrices origin. But Quechers. method is simple, fast phase extraction sample, with the largest number of pesticides determined at the same time, higher reliability and simultaneously lower costs compared to two other methods. During the study the degradation of acetamiprid in pepper and imidacloprid in tomato was observed that, in dealing with the maximum recommended dose, pre harvested interval time is larger than 7 recommending days. For this reason, we would recommend that in the period of harvest, treatment of products become only with the minimum dose (~ 5 days), or to apply other treatment alternatives with lower degradation period. Our laboratories are able to evaluate the analytical methods used and recommended by the EU for pesticide residues. Undoubtedly should be aimed at improving the performance of analytical techniques available today, as well as further expansion of the range of substances analyzed to provide higher levels of human health protection.

115

LITERATURA Alba, A. F. (2004). Chromatographic-mass spectrometric food analysis for trace determination of pesticide residues. WILSON &WILSON'S. Ardrey, R. (2003). Liquid-chromatography-mass spectrometry: introduction. Casa Editrice WILEY-INTERSCIENCE.

an

Bayer. (2014). Katalogu i produkteve. Bayer CropScience. Cara, M. (2007). Evidentimi i nivelit të mbetjeve, shkallës së degradimit të disa pesticideve dhe vlerësimi i impaktit të tyre në mjedis. Albania. DFG. (1992). Manual of PesticideRresidue Analysis Volume II. Germany. DI Muccio, A. (2006). Application of solid-phase extraction and liquid chromatography–mass spectrometry to the determination of neonicotinoid pesticide residues in fruit and vegetables. Elbert, et al. (2008). Applodet aspects of neonicotinoid uses in crop protection. In A. Elbert, Pest Menagement Sciences (pp. 1099-1105). FAO. (1989). International Code of Conduct on the Distribution and Use of Pesticides. Rome, Italy. Gandhi, R., & Snedeker, S. (1999). Pesticide Residue Monitoring and Food Safety. Cornell: Cornell Center for the Environment. Hopwood, J.; Black,S; Vaughan, M; Lee-Mäder. (2013). Beyond the Birds and the Bees. Effects of Neonicotinoid Insecticides on Agriculturally Important Beneficial Invertebrates. In J. Hopwood, The Xerces Society for Invertebrate Conservation (p. 32). Academic Press - Elsevier. Kadenczki, L., Arpad, Z., Gardi, I., Ambrus, A., Gyorf, A., & Reese, G. (1992). Column extraction of residues of several pesticides from fruits and vegetables. AOAC Intl., 75, 53-61. Kamrin, M. (2000). Pesticide Profiles. New York: Lewis Publisher CRC. Krupke, C. H., Hunt , J .G., Eitzer, D., Andino, G., & Given, K. . (2012). Multiple reputes of pesticide exposure for honey bees living near agricultural fields. PLoS ONE VII. Muir, P. (2002). The History of Pesticides Use. USA: Oregon State University Press.

116

Nollet, L., & Rathore, H. (2010). Handbook of Pesticides. Methods of Pesticide Residues Analysis. International Standard Book Number: 9781-4200-8245-6 (Hardback). Othmer, K. (1996). Encyclopedia of Chemical Technology. New York, USA: John Wiley and Sons Inc. Raina, R. (2011). Chemical Analysis of Pesticides Uusing GC-MS/MS and LC-MS/MS. In M. Stoytcheva, PESTICIDES - STRATEGIES FOR PESTICIDE ANALYSIS (pp. 105 -131). INDIA. SANCO/12571/2013. (2013). Guidance document on analytical quality control and validation procedures for pesticides in food and feed. SANCO/12571/2013. SANCO/12571/2013. (2013). Method validation and quality control procedures for pesticide residues analysis in food and feed. Scientific Report Of EFSA. (2013). European Union Report on Pesticide Residues in Food. EFSA Journal, 11(3):3130. Sheets, P. L. (2010). Imidacloprid: A Neonicotinoid Insecticide. In R. Kriege, & R. Krieger (Ed.), Hayes’ Handbook of Pesticide Toxicology (p. 2055). Oxford, UK: Academic Press - Elsevier. Stoytcheva, M. (2011). Pesticides in the Modern World – Trends in Pesticides Analysis. Janeza Trdine 9, 51000 Rijeka, Croatia: ISBN 978-953-307437-5. Vidal, J. M., & Frenich, A. G. (2006). Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe Approach for Determinig Pesticide Residues. In S. Lehotay, Pesticide Protocols (pp. 248 - 272). Humana Press. Waxman, M. F. (1998). Agrochemical and Pesticides Safety Handbook. Lewis Publishers. WHO/UNEP. (1990). Public Health Impact of Pesticides Use in Agriculture, Geneva,. Wiesner, P., & Kayser, H. (2000). Characterization of nicotinic acetylcholine receptors from the insects Aphis craccivora. Myzus persicae, and Locusta migratoria by radioligand binding assays: Relation to thiamethoxam action. J. Biochem. Mol. Toxicol, 221–230.

117

Youdeowei, A. (1983). Pest and Vector Management in the Tropics. London and New York.: Longman. Zheng, W., & Liu, W. (1999). Kinetics and mechanism of the hydrolysis of imidacloprid.

118