Fundamentos de virología Juan D. Rodas, MV, Ph.D* Esta es una mini-revisión de los aspectos más básicos de la virología veterinaria y como tal no ambiciona tratar temas muy especializados o ahondar en la virología patogénica. Esta dirigida a los estudiantes de veterinaria de segundo nivel dentro de la asignatura Mecanismos generales de salud y enfermedad de la versión tres y para los estudiantes del curso de microbiología para zootecnia. Historia de los virus Los virus son tan antiguos como la vida misma y son en esencia los más simples de entre los microorganismos de importancia para el hombre y los animales domésticos. Existen registros de enfermedades virales de muchos antes de que se tuviera siquiera conciencia de la naturaleza de los agentes que las producían. Hay monolitos y momias de los reyes egipcios que datan de los siglos X y XV antes de cristo que muestran secuelas de las que bien podrían haber sido infecciones causadas por los virus de la poliomielitis y la viruela. También, ya en el siglo X los chinos experimentarían con una de las formas más primitivas de vacuna viral conocida, al darle a “respirar” a las personas sanas, las costras derivadas de lesiones pustulosas de la viruela, de pacientes con la enfermedad. Todo esto con el fin de exponerlos a lo que estaba causando dicha lesiones, incitando así cuando no la enfermedad, la respuesta inmune contra un antígeno viral vivo. Muchos años después, en 1798, Edward Jenner aplicaría una forma mucho más atenuada de “vacuna”, al reconocer que las personas expuestas al virus de la vaccinia (un poxvirus bovino causante de una enfermedad parecida en el ganado) resistían el desafío con el poxvirus humano causante de la viruela humana. De esta manera Jenner pasaría a los libros de historia como el inventor del primer biológico conocido como “vacuna” en honor al hecho de haber sido preparada a partir de bovinos. Durante el siguiente siglo (XIX), Robert Koch y Luis Pasteur empezarían, aun sin saberlo, a sembrar las semillas de las que se nutriría la virología como ciencia al enunciar la teoría infecciosa del origen de las enfermedades y los postulados esenciales para descubrir los agentes etiológicos de las mimas (principios que sobreviven hasta nuestros días) dando así un golpe mortal a la tan debatida y controversial idea de la “generación espontánea”. Posteriormente Koch por su lado y Pasteur por el suyo desarrollarían respectivamente, los cultivos puros de bacterias y la segunda vacuna antiviral esta vez contra la rabia en 1880 y 1885 respectivamente. También en aquél entonces, Chamberland, discípulo de Pasteur, empezaría a experimentar con los filtros de porcelana para obtener agua bacteriológicamente pura, los cuales serían empleados por Ivanowski en 1892 con el fin de demostrar que realmente los fluidos obtenidos de las plantas infectadas con el mosaico del tabaco no contenían una toxina si no más bien como lo bautizaría luego Beijerinck en 1898, un “virus” liquido viviente. * Profesor asociado de la Facultad de Ciencias Agrarias en las áreas de Microbiología y Proyectos en Salud Animal. III y miembro de los grupos Centauro de la misma facultad e Inmunovirología de la Sede de Investigación Universitaria, SIU. Ubicación: Ciudadela Universitaria de Robledo, Carrera 75 # 65-87, Oficina 47-150, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia, AA 1226

2 Solo bastarían 10 años mas para que Loefler y Frosch descubrieran el primer virus causante de una enfermedad animal, la fiebre aftosa y tres años más tarde, Walter Reed descubriría el agente que ocasiona la fiebre amarilla humana. Son muchos los eventos que condujeron al fortalecimiento de los fundamentos de la virología, más sin embargo uno que no podría quedarse ausente de este recuento es el descubrimiento de los “bacteriófagos”, o literalmente “virus comedores de bacterias” descritos por primera vez por los investigadores D´Herelle y Twort entre 1915 y 1917. Casi por coincidencia, como sucedieron muchos de los grandes descubrimientos de la ciencia, (pero en manos de una mente inquieta) estos dos científicos trabajando en forma independiente, relatarían la presencia de placas “traslúcidas” en medio de la monocapa de colonias de bacterias. Al estudiar en forma mas detallada el fenómeno dieron así inicio a una de las herramientas más poderosas para el conocimiento de métodos de replicación viral, estudio de las interacciones de los virus con sus hospederos y la naturaleza física, química y estructura de estos que fueron excelentes modelos para todos los demás virus de importancia en todos los organismos vivos y en particular de los virus de animales. Alrededor de 1930, cuando se inicia el uso de los huevos embrionados, los ratones y las aves como modelos animales ideales para el estudio in vivo de las características de los agentes virales; por Woodruff y Goodpasture. Sin embargo solo en 1949, John Enders trabajaría arduamente en la producción de los primeros cultivos in vitro de células, que serían esenciales para el aislamiento y la tipificación de los agentes patógenos causantes de muchas de las enfermedades humanas y animales aun huérfanas de etiología. Haciendo un pequeño paréntesis, vale la pena mencionar que solo 40 años después del descubrimiento de los primeros virus, en 1939, se observarían por primera vez estos microorganismos, al desarrollarse el microscopio electrónico. Habíamos pasado la mitad del siglo XX y aun no sabíamos exactamente como cuantificar los efectos citotóxicos de los virus y determinar su potencia en suspensión, hasta cuando Dulbecco sugiere, basado el uso de los métodos de placas usados en bacteriófagos, la determinación de la concentración de los virus a través del uso de medios de crecimiento semisólido que impedían la movilidad del efecto citopático y así producían un efecto similar que facilitaba su cuantificación. Luego de contar con tan “sofisticados” instrumentos para lograr medir y manipular con mayor precisión estos agentes sub-microscópicos, se abren múltiples avenidas para el descubrimiento todo tipo de interacciones de los virus con sus hospederos, tales como la posibilidad de los virus inactivados para despertar una respuesta inmune efectiva en la vacuna contra la poliomielitis, desarrollada por Jonnas Salk y la descripción del interferón (IFN), como una de las moléculas más efectiva para controlar la diseminación de las infecciones virales en forma inespecífica, por parte de Isaacs y Lindenmann en 1957. Posteriormente, Temin y Baltimore, descubren también en los virus, la enzima que desafiaría uno de los mayores paradigmas de la biología molecular, al describir la transcriptasa reversa que como su nombre lo insinúa, reversa el flujo de la información de ARN a ADN. Esta misma enzima sería también descubierta en el virus que sin lugar a dudas, ha motivado el mayor nivel de investigación científica en toda la historia de la virología y representa aún un enigma, el de la inmunodeficiencia humana, cuyo descubrimiento fue simultáneamente registrado por los grupos de R. Gallo en Estados Unidos y L. Montagner en el Insituto Pasteur en Francia.

3 Por último vale la pena mencionar que el desarrollo de la biología molecular permitió detectar e identificar agentes virales no cultivables in vitro, causantes de enfermedades humanas o animales aún huérfanas de etiología, tales como el de la hepatitis C humana. Es así como gracias al uso por ejemplo, de sondas de ácidos nucleicos marcadas radiactivamente (segmentos de nucleótidos con la secuencia específica para aparearse con el genoma del agente buscado), o más tarde al PCR, se pudo determinar la existencia de nuevos agentes viejas patologías y desde entonces este campo de diagnóstico y esta estrategia de investigación no ha cesado de crecer. Tamaño, forma, estructura, nomenclatura y clasificación Los virus, a diferencia de las bacterias que se miden en micras (10-6 m), se miden en nanómetros (10-9 m) y su rango común va desde 20 hasta 300. Sus formas dependen de la membrana celular o la estructura de la cápside y son variadas, desde circulares hasta pleomórficos. En cuanto a su estructura, está realmente dictada por la disposición geométrica de los componentes de la cápside (más adelante nos ocuparemos de éste aspecto). De otro lado, en lo que tiene que ver con su clasificación, los virus, así como todos los organismos superiores se agrupan en órdenes, familias, subfamilias y géneros. El concepto de especie es bastante controvertido en estos microorganismos pues debido a su alta variabilidad genética y su tamaño, los virus son difícilmente identificables como estructuras individuales e independientes y por ende siempre se agrupan como una población cuya homogeneidad sugiere la aplicación del concepto de causi-especies como algo más en tono con la realidad. Un ejemplo de tal ubicación de los virus de acuerdo con su forma, tamaño, estructura y clasificación, estaría dado por el grupo de los virus del orden mononegavirales que esta conformado por virus que tienen RNA no segmentado de polaridad negativa. Dentro de este orden encontramos las familias Paramyxo, Rhabdo, Filo y Bornaviridae; de las cuales la segunda, la rhabdoviridae, estaría a su vez conformada por los géneros lyssa y vesiculovirus; dentro de los que encontramos respectivamente los virus de la Rabia y la Estomatitis vesicular. En cuanto a su nomenclatura, los virus son nombrados de acuerdo con un sin número de características entre la cuales cabe contar: 1) su forma; así por ejemplo los togavirus recibieron su nombre por que tienen una envoltura que se visualiza al microscopio electrónico y los coronavirus por su envoltura con proyecciones en forma de corona; 2) la entidad clínica que producen; así por ejemplo los Flavivirus (de flavus: amarillo), están asociados con infecciones que producen ictericia; 3) la vía de entrada o el tejido que atacan, en estos grupos podemos mencionar los enterovirus y los hepadnavirus; 4) su forma; por ejemplo la familia Rhabdoviridae (en forma de bala); 5) la estructura del genoma; ejemplo: familia Birnaviridae (dos moléculas de ARN); 6) características exclusivas de su composición; ejemplo: Retroviridae (que portan transcriptasa reversa) y otras más. Anatómicamente los virus están básicamente formados por una cápside o cubierta proteica que recubre el genoma. La cápside puede adoptar una de dos simetrías: icosahédrica, que es una figura geométrica con forma de hexágono cuando se le observa de frente, pero que en realidad posee 20 caras triangulares; y la helicoidal, la cual tiene forma de espiral cubierta de proteínas. Los virus que poseen esta última conformación generalmente poseen ARN. Precisamente hablando acerca del genoma, los virus también se caracterizan por que a diferencia de las bacterias, ellos poseen solo uno de los dos ácidos nucleicos, ADN o ARN. Siguiendo con la anatomía de un virus, la

4 cápside esta compuesta por sub-unidades denominadas capsómeros, y a la unión genoma y cápside se le conoce como núcleo-cápside. Como ya se mencionó, algunos virus presentan también una característica adicional y es la envoltura, la cual proviene de las células que infectan y que por lo tanto es una bi-capa de naturaleza lipídica que contiene diversos tipos de proteínas incrustadas y cuya síntesis depende de la información genética del virus. Estas proteínas de la envoltura son supremamente importantes para la vida del virus pues es precisamente a través de ellas que dichos agentes se adhieren a proteínas específicas en la superficie de la célula y que llamamos receptores virales. Dichos receptores no están allí solo para cumplir esta función si no que son además moléculas usadas por las células para otros trabajos fisiológicos. Así por ejemplo encontramos como el receptor para el virus de la rabia a nivel del sistema nervioso, es el mismo receptor de la acetilcolina. Algunas de las proteínas de la envoltura viral están conjugadas con azúcares por lo que se les denominara glicoproteínas y existe una variedad de las mismas; entre otras: Hemoaglutininas (las que aglutinan glóbulos rojos de alguna especie y son encontradas por ejemplo en los virus de influenza y en los parvovirus ), Neuraminidasa (o proteína que disgrega las partículas virales neo-formadas que salen de la célula infectada, también presentes en los virus de influenza) o las proteínas de fusión (observadas en los virus que usan esta vía de penetración y que interactúan con otras proteínas a nivel celular para la entrada del virus a la célula susceptible. La presencia o ausencia de membrana en los virus, ha dado lugar a la clasificación de virus en envueltos y desnudos; lo cual repercute sobre la sensibilidad que estos puedan o no tener a los solventes orgánicos y los detergentes. También debido a lo anterior, los virus envueltos se consideran más sensibles, en general, a las condiciones medioambientales tales como el calor y la desecación. Por último, a pesar de que no existe realmente tal cosa como un virus de vida “independiente”, a la partícula viral que se encuentra en forma extracelular, se le conoce con el nombre de “virión”. En lo que se refiere a las características de su genoma, los virus poseen tamaños de ARN o ADN que van desde tan solo 3.2 Kb (kilobases o mil bases o mil nucleótidos) en agentes como el de la hepatitis B, hasta 191 Kb en agentes tan complejos como los Poxvirus (como el virus de la vaccinia o el virus de la viruela humana). Lo anterior sugiere que si bien la cantidad de información genética que requieren para reproducirse, no es mucha y además poseen estrategias moleculares para hacerla rendir aún más; los virus mas grandes poseen un “exceso” de capacidad de codificación que utilizan para producir otras proteínas con papeles diversos en la infección, lo que plantea relaciones mucho más complejas (bloqueo de la respuesta inmune, capacidad de producir efecto patogénico, mayor transmisibilidad), muchas de ellas aún no totalmente esclarecidas En cuanto a su naturaleza, los genomas pueden poseer cadenas sencillas o dobles, que además pueden ser únicas (es decir solo un fragmento) o segmentadas, y presentar disposición circular o linear. Replicación viral Los virus son parásitos intracelulares obligatorios, es decir que ellos necesitan la maquinaria celular para replicarse y producir una nueva progenie viral y aquí se encuentra otra de las grandes diferencias con las bacterias. Esto se debe a que los virus no poseen organela alguna capaz de ayudarles a procesar los nutrientes que obtienen de sus hospederos, como si es el caso en las bacterias que si tienen ribosomas para traducir sus propias proteínas a partir de fuentes externas de aminoácidos.

5 Dentro del ciclo replicativo o reproductivo de los virus en las células, existen algunos pasos comunes arbitrariamente diferenciados para su estudio pero difícilmente separables en forma independiente; no solo por que hacen parte de un movimiento continuo de ciclo vital, sino también por que en la práctica son difícilmente observables y rastreables. Una vez el virus se adhiere y penetra la célula susceptible, prácticamente nos volvemos ciegos a lo que pasa en el interior de la célula hasta que el virus empieza a salir de ella. En términos generales podemos hablar de siete (7) pasos característicos de la replicación viral que son relatados a continuación: 1) Adherencia: este evento esta asociado totalmente con el tropismo o en otras palabras plantea la susceptibilidad que un tipo dado de célula pueda presentar por un virus en particular. Este paso depende de la interacción física entre las proteínas externas del virión (llamadas “ligandos”) y las de la superficie de la célula hospedera/blanco (llamados “receptores”). Típicamente esta interacción es de tipo receptor-ligando, lo que determina especificidad de especie o especificidad de tipo celular. Sin la adherencia, la infección viral no puede ocurrir, sin embargo no todos los anclajes resultan en infección productiva. En ocasiones pueden darse otras “relaciones tales como: a) la infección abortiva, la cual no sostiene la producción de progenie viral (debido a que aunque la célula sea susceptible, podría no poseer las enzimas necesarias para que el virus produzca nuevas partículas virales, en este tipo de infección solo unos cuantos genes virales pueden expresarse), b) la infección restrictiva, también llamada “transitoriamente permisiva”, en la cual el virus permanece en la célula ya sea hasta que esta se vuelva permisiva o a que solo unas pocas células en una población produzcan progenie viral en algún momento, c) la infección persistente o latente, en la cual el signo principal es la persistencia de los genomas virales, sin la concomitante producción de partículas infecciosas (virus) y finalmente, d) la infección productiva que ocurre solo en células donde la disponibilidad de enzimas y de señales celulares sean las más indicadas, para que el virus se replique y produzca una progenie viral completa. En resumen de este paso, la adherencia es necesaria pero no asegura que la replicación va a continuar. 2) Penetración se refiere a la introducción del ácido nucleico viral dentro de la célula, a la internalización de la nucleocápside vía endocitosis mediada por receptores o fusión de la envoltura viral con la membrana plasmática. Como resultado inmediato, el ácido nucleico (viral) se localiza ya sea en el citoplasma o dentro de una vesícula endocítica 3) Desnudamiento, que es la separación del ácido nucleico de la nucleocápside, lo puede requerir la participación de proteínas hospederas u otros factores. El desnudamiento es un prerrequisito para la expresión del genoma viral. Después de la decapsidación, el ácido nucleico viral puede seguir alguna de dos alternativas: continuar hacia el ciclo de replicación o permanecer quiescente, ya sea en forma integrada (como una copia del genoma viral integrado al genoma de la célula hospedera, como en el caso de los retrovirus) o independiente (“dormido”, latente como en el caso de los herpesvirus) hasta que sea activado para re-iniciar su ciclo activo de replicación. 4) Trascripción y traducción (síntesis de proteínas o expresión genética) se produce ARN mensajero (ARNm) y éste es traducido a proteínas virales, independientemente de la naturaleza genética del virus, es decir, de si su genoma es un ADN o un ARN, si es de una sola o de doble cadena, segmentado o no, de polaridad positiva o negativa, el genoma tiene que producir un ARNm que pueda ser reconocido y traducido por la maquinaria de la célula hospedera, con el fin de producir las proteínas estructurales y no

6 estructurales, necesarias para la multiplicación viral. Se ha descrito que los virus utilizan diversos mecanismos a través de los cuales secuestran o manipulan la maquinaria de la célula hospedera para que se dedique principalmente a la síntesis de productos virales, y no de productos celulares. 5) Replicación del genoma: El mecanismo de replicación genómica varía de acuerdo al tipo de ácido nucleico, su organización, estructura y topología. Para algunos de los virus más simples, este proceso podría ser llevado a cabo por las enzimas y factores de la célula hospedera; sin embargo, la mayoría de los virus codifican sus propias enzimas de replicación. Para algunos otros como aquellos que poseen lo que llamamos por convención ARN de polaridad negativa, el llevar su propia enzima para transcribirse en ARN mensajero es una condición indispensable para iniciar su replicación. 6) Ensamblaje de partículas virales completas. La maduración de virus desnudos, es principalmente el ensamblaje del genoma viral más las proteínas de la cápside para formar la nucleocápside. Esto ocurre espontáneamente a través de interacciones proteína-proteína y proteína-ácido nucleico. En la maduración de los viriones envueltos, la nucleocápside adquiere una envoltura externa formada por membranas de la célula hospedera (membrana nuclear, de aparato de Golgi, de retículo endoplásmico o de membrana plasmática), la cual contiene una bi-capa lipídica de origen celular con proteínas codificadas por el virus. 7) Liberación de los viriones. En el caso de los virus desnudos o sin envoltura, son liberados miles de viriones progenie a través de la muerte y la lisis celular. En el caso de los virus envueltos, los viriones progenie son liberados por protrusión de yemas hacia el exterior de la célula (gemación), y este proceso no necesariamente provoca la muerte celular. Aunque algunos virus envueltos también pueden ser liberados a través de lisis celular. Patogénesis viral : aunque no restringido únicamente a los siguientes dos ítems, este tema esta principalmente representado tanto por mecanismos de entrada a los hospederos susceptibles como por las interacciones de los virus con ellos, desde el momento que el agente infeccioso entra en contacto con el individuo, hasta cuando el mismo sale a infectar o ser transmitido a uno nuevo a) Vías de entrada de los virus al hospedero susceptible Los virus generalmente penetran al organismo a través de alguna de las siguientes vías: a) con el aire que respiramos y las pequeñas gotas se suman y forman aerosoles que penetran a través de mucosas, b) con los líquidos o los alimentos que consumimos, invadiendo el tracto digestivo, c) a través de la conjuntiva ocular, d) a través del contacto sexual, que expone la mucosa del tracto urogenital a los gérmenes, d) por medio de cualquier solución de continuidad (herida) en la piel y e) a través de vectores que inoculan los virus directamente en los capilares sanguíneos o cualquier otro medio artificial de transgredir la piel como barrera natural, por ejemplo el uso de agujas hipodérmicas y otros artefactos.

7 b) Diseminación de los virus dentro de los hospederos Una vez los virus han entrado al hospedero susceptible por cualquiera de las vías antes descritas siguen un patrón de diseminación que varía tanto de acuerdo con el tropismo como con el tipo de infección que producen. En general podríamos decir que después de infectar los epitelios externos y las mucosas, los virus viajan a los nódulos linfoides regionales y de allí a la circulación periférica para producir una viremia primaria que en la mayoría de los casos resulta prácticamente imperceptible para el clínico. Luego de esta etapa, los virus viajan a los órganos del sistema retículo endotelial que reciben las células que patullan el organismo presentando antígenos al sistema inmune (médula ósea, hígado, bazo y endotelios). Luego de esta fase de amplificación parcial, los virus regresan a la sangre, produciendo una segunda viremia, esta generalmente mucho más notoria que la primera, particularmente en las infecciones generalizadas (o también las transmitidas por vectores, las cuales requieren por definición de un alta viremia que asegure su transmisión), para terminar replicándose en los órganos blanco de la infección viral que serían por ejemplo, para el caso del distemper canino, los epitelios del tracto respiratorio inferior y del tracto gastro-intestinal, produciendo bronquitis, bronco-neumonía y bronquitis catarral o vómito y diarrea acuosa respectivamente (aunque en ocasiones también podría afectar el sistema nervioso como fase crónica tardía de la infección). En otros casos como con los virus de la rabia y el polio, por ejemplo, los agentes infectan finalmente las glándulas salivales y el sistema nervioso central y periférico respectivamente, produciendo ya sea cambios del comportamiento como agresividad que induce al perro a morder, o parálisis flácida de los miembros inferiores como en el segundo caso. Un tercer ejemplo podría ser el de agentes que infectan a través del tracto respiratorio y se diseminan finalmente a, y desde, la piel a otros individuos, tales como el herpes zoster y la viruela humana. Una anotación adicional que es necesario hacer, al hablar de la capacidad de diseminación de los virus, es que algunos producen infecciones localizadas tales como lo papilomas, mientras que otros ocasionan enfermedades que se generalizan tales como el New Castle de las aves. De estos ejemplos se desprende también que en el primero de los casos generalmente no detectamos, viremia ya que el agente no se disemina en el organismo del hospedero. Podríamos también decir que generalmente las infecciones localizadas están asociadas con enfermedades más benignas o autolimitantes y por lo tanto la vida del individuo infectado no se ve comprometida, mientras que las infecciones generalizadas tienden a ser más agresivas y por lo tanto más letales. En el mismo orden de ideas también podemos encontrar agentes que producen infecciones agudas y otros asociados a infecciones crónicas, y en ese sentido, las primeras (como ejemplo el sarampión), tienen un período de incubación mucho más corto, a la vez que usualmente producen brotes con mayor facilidad, pero generalmente, también inducen una respuesta inmune post-infección más efectiva. De otro lado, los agentes asociados con infecciones crónico-persistentes o latentes, tales como el virus de la enfermedad de Marek, que tienden a permanecer en el hospedero que atacan y no generan un muy buen reconocimiento por parte del sistema inmune. Respuesta inmune Sin el ánimo de hacer un recuento pormenorizado de la respuesta inmune antiviral, mencionaré alguno de los elementos comunes a la inmunidad anti-microbiana, resaltando los aspectos más relevantes en la respuesta contra los virus. Comencemos

8 diciendo que al igual que en la respuesta inmune anti-bacteriana, las barreras naturales tales como la piel, con sus ácidos grasos, ciertas vellosidades como las pestañas, el efecto mecánico de las lágrimas, el pH extremadamente ácido del estómago, el moco de los tractos respiratorio que junto con las cilias ayudan a extraer las partículas del tracto respiratorio para ser deglutidas, los movimientos peristálticos del intestino y el efecto de barrido de la micción; representan la primera, y una de las más efectivas líneas de defensa contra los agentes infecciosos. En un segundo nivel estarían los mecanismos de defensa de la inmunidad innata dividida en unos componentes celulares y otros componentes solubles. Dentro de los primeros podemos describir los macrófagos, las células dendríticas, las células NK (o asesinas naturales) y los polimorfo-nucleares. Los primeros dos grupos de células, serían los que “patrullan” el organismo, viajando a través de los diferentes órganos y tejidos para fagocitar, digerir y presentar todo lo considerado “foráneo” a las células CD4+. Estas a su vez son células más especializadas en el proceso de “transmisión”, amplificación y polarización de la respuesta inmune especifica de tipo humoral a los linfocitos linfocitos B, que serán finalmente los encargados de la producción de anticuerpos o inmunoglobulinas. Las células NK por su parte, están encargadas de controlar en “forma” más directa e inespecífica, cualquier célula del organismo que este exhibiendo “características fenotípicas anormales” o de otra forma que no sea capaz de identificarse como parte de lo “propio” del organismo, ya sea por infección viral o por ser parte de un crecimiento celular desorganizado (tumoral). Los polimorfo nucleares por su parte, son tan activos contra los virus como lo son contra las bacterias (incluso tal vez más para estas últimas) y cumplen también una función de “barrido” y control inespecífico, gracias a mecanismos generadores de iones dependientes del oxígeno y del nitrógeno, entre otros, que favorecen la destrucción de todo tipo de partículas fagocitadas por ellas. Dentro del los componentes solubles, las quimioquinas, de las cuales un buen ejemplo es la IL-8, favorecen la transmisión de la señal de la “necesidad de producción de la respuesta inmune” a los sitios donde se ha presentado la injuria; de esta forma atraen otros actores importantes de la misma tales como los PMN y otros. Las citoquinas y entre ellas muy en particular los interferones alfa y beta, producidos por las células infectadas con virus, inducen un estado de “defensa inespecífica” en las células vecinas, contra las formas intermedias producidas a nivel del ciclo de replicación de los mismos, controlando de esa forma su multiplicación. El complemento, está formado por una serie de proteínas con poder lítico que se genera en respuesta a el aumento de “moléculas comunes a los agentes infecciosos” o en respuesta a el aumento de complejos inmunes formados entre antígenos y anticuerpos, con el objetivo de ayudar a destruir en forma inespecífica los microorganismos que estén atacando el sistema. Finalmente, las proteínas de fase aguda son las responsables de generar entre otras cosas, el aumento de la temperatura corporal y la salida de los mediadores químicos de la inflamación a los tejidos donde se requiera la presencia de elementos celulares de la inmunidad innata. Por su parte, la respuesta inmune especifica estaría mediada por los linfocitos T CD4+ y CD8+ y los linfocitos B. Los primeros (linfocitos T CD4+), sirven fundamentalmente como reguladores de la respuesta inmune adaptativa, a través de la secreción de citoquinas (hormonas del sistema inmune), que polarizan la inmunidad en la dirección celular o humoral, las cuales son a su vez ejecutadas por los linfocitos T CD8+ y linfocitos B, respectivamente. La acción citotóxica de los linfocitos T CD8+, se da de dos maneras principales, la primera es un efecto directo sobre células infectadas, gracias a la liberación de proteínas (perforinas) que producen agujeros en la membrana

9 plasmática, induciendo la muerte de células infectadas por un efecto osmótico, y la segunda, por inducción de apoptosis (muerte celular programada) inducida por la liberación de proteínas llamadas granzimas. Los linfocitos B por su parte, son los encargados de producir los distintos tipos de inmunoglobulinas con acciones tan diversas como la opsonización que favorece la fagocitosis, la neutralización de los virus y la lisis de células dependiente de complemento o células citotóxicas. Diagnóstico de las infecciones virales Desde su descubrimiento y debido a su particular tamaño, la visualización de los virus ha sido una de las mayores limitaciones para su diagnóstico y es aún en la actualidad, debido a la escasez y el costo de instrumentos tan sofisticados como el microscopio electrónico un privilegio de pocos y una técnica que casi nunca se usa en la práctica para el diagnóstico rutinario. Precisamente debido a la dificultad para observarlos y a su condición de parásitos intracelulares obligatorios, desde los inicios de la virología, nos hemos tenido que valer de pruebas indirectas para comprobar su presencia tales como el efecto producido sobre animales de laboratorio (ratones y aves primero y luego hamsters, curies, ovejas, cabras, perros y micos entre otros), huevos embrionados, cultivos primarios de células a partir de tejidos o en líneas celulares. Estas últimas, que parecerían ser las herramientas más apropiadas (las líneas celulares), también debieron esperar el desarrollo de medios de crecimiento adecuados y condiciones de esterilidad que permitieran crecer, aislar y tipificar los virus. Incluso, luego de el advenimiento de todas estas herramientas, aun siguen existiendo dificultades tanto económicas como técnicas para implementar el uso común de dichos métodos en nuestro medio. Como consecuencia de los argumentos presentados, se han desarrollado múltiples alternativas para detectar no solamente en forma directa, es decir a través de la identificación de las proteínas (antígenos) y material genético (ácidos nucleicos), si no también de manera indirecta, por la medición de las respuestas inmunes (anticuerpos dirigidos contra ellos), diversos técnicas para diagnosticar las causas más comunes de las enfermedades infecciosas producidas por ellos. De acuerdo con lo anterior, uno de los métodos más comúnmente usados en el diagnóstico de laboratorio para virología en la actualidad es la detección tanto de antígenos virales como de anticuerpos contra los mismos a través de la prueba inmunoenzimática denominada ELISA que nos permite, gracias a la acción de un componente denominado “conjugado”, formado por un anticuerpo unido a una enzima, detectar los primeros o los segundos. En una forma muy simple se podría explicar que la presencia de anticuerpos en una muestra se puede evidenciar contando con el antígeno viral adherido a una matriz plástica, a la cual se adiciona el suero o plasma que se espera contenga las inmunoglobulinas. A continuación se usaría el mencionado conjugado, que sería en este caso un anticuerpo contra los anticuerpos de la especie de la cual se tomo la muestra adherido, como ya se dijo, a una enzima tal como la fosfatasa alcalina (este segundo anticuerpo generalmente es desarrollado en conejos, carneros u otro animal de granja usado a nivel comercial). Posteriormente se adicionaría un sustrato sobre el cual actuaría la enzima del conjugado, para evidenciar por el cambio de color la presencia de anticuerpos en la muestra original y en caso contrario, por la ausencia del mismo, la carencia de aquellos. Sin el animo de entrar a explicar la mecánica de cada una de las técnicas, vale la pena mencionar que existen así mismo una gran variedad de pruebas, unas más clásicas, otras

10 más modernas, que permiten llegar a una determinación parecido; ya sea por detección directa del agente o por detección indirecta de la respuesta inmune humoral que los virus indujeron. Entre otras vale al pena mencionar la inmuno-difusión, la fijación del complemento, la hemoaglutinación, la neutralización viral, la inmuno-fluorescencia etc. Por su parte el PCR o reacción en cadena de la polimerasa, es la técnica molecular tal vez más empleada en nuestros días, para el diagnóstico genético de las infecciones de toda índole, incluyendo las virales. Esta se basa, explicada de una manera muy simple, en el uso de fragmentos conocidos que se aparean con la secuencia específica de los ácidos nucleicos que conforman el material genético del microorganismo en estudio. La utilización de dichos “cebadores” en conjunción una enzima termoestable permitirían la síntesis de nuevas cadenas correspondientes al DNA de agente infeccioso, las cuales serían posteriormente reproducidas hasta una cantidad que puede ser observada con la ayuda de la electroforesis. Eco-epidemiología Tal vez podríamos decir que la eco-epidemiología de la infección viral se encarga de estudiar los virus en contexto; o en otras palabras es el estudio de la distribución y determinantes de las infecciones virales en las poblaciones, teniendo en cuenta la interacción de los hospederos con su entorno. Los virus han aprendido a utilizar varias estrategias para su supervivencia, algunas de las más comunes son la infección autolimitada acompañada de una alta contagiosidad, así favorecen la supervivencia de los hospederos a la vez que lo hacen con la propia, a través de un parasitismo “limitado” en el hospedero potencial. Dos ejemplos comunes de esta estrategia son los rhinovirus y los rotavirus. En un segundo lugar estarían aquellos agentes que son capaces de “perpetuarse” en sus hospederos manteniendo lo que podríamos llamar un “bajo perfil” para no ser detectados y expulsados, mientras al mismo tiempo logran no solo permanecer en el individuo, si no también transmitirse aunque tal vez no con tanto éxito como los primeros. En este grupo encontramos los virus de las leucosis aviar y bovina. En tercer lugar podríamos hablar de aquellos agentes que han desarrollado la capacidad de infectar múltiples hospederos y entre ellos encontramos los virus que llamamos zoonóticos (que se transmiten de los animales al hombre o viceversa) y los arbovirus (o virus transmitidos por artrópodos). Dentro de esta clasificación podemos hablar del virus de la rabia y el virus de la encefalitis equina venezolana, ambos zoonóticos y el segundo un arbovirus. De acuerdo con la forma en que son transmitidos de un hospedero a otro podemos mencionar: a) la vía aérea para los virus respiratorios y aquellos que se transmiten por la saliva, tales como los virus de la influenza, del resfriado común (rhinovirus), el sarampión y los herpes, respectivamente; b) la vía fecal-oral por la cual se trasmiten los rotavirus y los enterovirus (polio); c) la vía sexual, asociada con las que popularmente se conocen como enfermedades venéreas, entre las cuales encontramos el herpes genital (generalmente asociado con herpes humano tipo 2), el herpes virus bovino 1 causante de la vulvovaginitis y balanopostitis en los vacunos, los papilomavirus humanos causantes de condilomas y el virus de la inmunodeficiencia humana (del cual también existen “parientes cercanos” en animales tal como el virus de la inmunodeficiencia de los simios); entre otros. Las infecciones virales también se clasifican de acuerdo a la fuente y el blanco de infección y así podemos encontrar que se habla de zoonosis o infecciones zoonóticas para definir aquellas enfermedades que son generalmente transmitidas de los animales

11 al hombre (aunque eventualmente la transmisión puede llegar a ser bi-direccional). Vale la pena anotar que en estas el hombre no pasa de ser considerado como un hospedero “accidental” debido a que no es un buen transmisor de la infección y por lo tanto no representa un eslabón necesario para la supervivencia del agente en la naturaleza. Dentro de este tipo de enfermedades zoonóticas, encontramos en primer lugar, aquellas en los cuales participan los vectores invertebrados (insectos), quienes transmiten directamente la infección al hombre (ejemplo: dengue). En segunda instancia, estarían aquellas en las cuales el virus pasa desde vectores vertebrados, mejor llamados “reservorios” (tipo roedores como en el caso de los hantavirus por ejemplo) u otros que mantengan el ciclo de infección del agente como hospederos naturales (tales como los murciélagos hematófagos para el virus de la rabia a nivel silvestre o los perros y los gatos a nivel urbano), al hombre. Por último, también son reconocidas aquellas infecciones que son pasadas de insectos a vertebrados (ejemplo: fiebre amarilla de mosquitos del genero Haemagogus a monos Cebus capuchinus) y de los mismos vectores (u otros “parientes” cercanos a los anteriores como los aedes) directamente al hombre (como en el caso del ciclo selvático y urbano de la fiebre amarilla para el hombre). Un segundo ejemplo más común para la veterinaria de este ultimo ciclo, sería el de la EEV donde un insecto del género culex transmite el virus a la rata espinosa dentro del ciclo selvático o interepidémico y el mismo insecto puede picar el caballo para producir un ciclo peri-doméstico en el cual participa un nuevo vector que es potencial transmisor del virus también al hombre en el ciclo epizoótico de la infección. Otro ejemplo de cómo un virus puede favorecer su supervivencia de una manera muy exitosa combinando varias de las posibilidades indicadas al comienzo, esta representado por el virus de la influenza, el cual si bien no es transmitido por vectores, si es diseminado fácilmente en forma de aerosoles. Este agente no solo tiene una gran variabilidad antigénica lo que le asegura una gran variedad de hospederos si no que también es “potencialmente” una zoonosis debido a su gran capacidad de “mutar” y adquirir la habilidad de infectar nuevas especies. Adicionalmente, también debido a su gran capacidad de cambio, le es posible re-infectar el mismo hospedero con variaciones muy leves de las proteínas superficiales de su estructura (hemoaglutinina y neuraminidasa, HA y NA o H y N). Terapia, prevención y control En el tema de la terapia antiviral solo quiero hacer mención del hecho de que a pesar de existir en la actualidad una explosión de drogas antivirales y muy en particular antiretrovirales, la mayoría de ellas son inasequibles por costos para su aplicación en el campo médico veterinario desde el punto de vista costo-beneficio. En lo que tiene que ver con los tipos de vacunas más empleados, valga la pena mencionar que las aproximaciones clásicas (y de hecho hasta ahora las mas exitosas), han estado basadas en dos formas de preparar el antígeno viral o inmunógeno: vacunas a base de virus vivo atenuado y las vacunas a base de virus inactivado o también llamadas vacunas a virus muerto. De las primeras vale la pena destacar que además de poder ser aplicadas por la vía natural de infección, tener un bajo costo y requerir menor número de dosis que las vacunas inactivadas, producen una inmunidad mas completa y duradera y no requieren adyuvantes (moléculas que ayudan a la presentación antigénica). Sin embargo es necesario reconocer que como inconvenientes, genera preocupación el hecho de que puedan revertir a la virulencia y que sean inactivadas por

12 el calor, por lo cual se debe garantizar una buena cadena de frío a la hora de aplicarlas y transportarlas. Por su parte las vacunas inactivadas, si bien, generalmente no inducen una buena respuesta inmune celular, requieren un mayor número de aplicaciones y del acompañamiento de adyuvantes, lo que las hace de hecho mas costosas y generalmente deben ser inyectadas; son mas resistentes al calor que las vivas atenuadas y además en ellas el virus no se replica y no puede recuperar su virulencia. Como vemos ambas aproximaciones reclaman sus propias ventajas y padecen sus propias desventajas, así que en la actualidad encontramos buenos ejemplos de ambas en el comercio para muchos de los virus de presentación habitual tanto en medicina humana como en medicina veterinaria. Una tercera aproximación a la prevención de las enfermedades virales a través de los biológicos, esta representado por las vacunas de nueva generación para las cuales se han empleado una gran variedad de estrategias; sin embargo tal vez las más comunes sean a) los virus usados como vectores de expresión para otros agentes, los cuales por su gran capacidad portar material genético foráneo, de infectar, inducir una buena respuesta inmune, y de ser seguros y fácilmente manipulables, han mostrado sus bondades en ensayos clínicos pero aún representan muy poco dentro de la realidad comercial para la inmuno-prevención b) la inoculación de material genético, particularmente ADN circularizado (o plásmidos, los cuales fueron originalmente descubiertos en bacterias y son empleados hoy en día como instrumentos para manipular y transportar información genética) envuelto en membranas liposolubles y con capacidad para inducir la síntesis de proteínas de origen viral cuando son intramuscularmente inyectados en animales de experimentación y c) proteínas “naturalmente” producidas por métodos de ingeniería genética, y purificadas en el laboratorio o sintetizadas a partir de secuencias conocidas. Las tres anteriores, representan avenidas muy promisorias de desarrollo de nuevas vacunas, más seguras y efectivas, pero aún muy pocas de ella han podido avanzar a su aplicación masiva en poblaciones humanas o animales. Emergencia y evolución viral Para terminar este resumen, vale la pena mencionar que aún nos quedan muchos virus por descubrir y que además es muy probable que los virus que hoy conocemos sigan evolucionando para favorecer su supervivencia. Por esto encontramos muy a menudo que el descubrimiento de los “nuevos” agentes puede ser generado por varios fenómenos 1) la invasión del hombre a nichos ecológicos que antes rara vez visitaba, haciéndose de esta forma un nuevo hospedero potencial en los ciclos de los agentes infecciosos que allí ya existían 2) la perturbación del equilibrio natural de la ecología por cambios climáticos dramáticos (fenómeno del niño o de la niña), desastres naturales (sequías, inundaciones, cataclismos, sunamis, hambrunas etc) u otros factores sociales o culturales (urbanización, explosión demográfica, el desarrollo de las comunicaciones y los medios de transporte) que favorecen ya sea el aumento en el numero de individuos de una población (llámese estos mosquitos, roedores, predadores o presas), el número de contactos entre ellos (los parásitos y sus hospederos) o el aumento de potenciales hospederos susceptibles que permitan llevar el fenómeno de las infecciones virales a los lugares donde estas antes no se habían observado 3) los cambios a nivel genético tanto de los virus como de sus hospederos. Este es un factor motivador de nuevas habilidades y nuevas posibilidades y juega un papel muy importante, particularmente en los virus por ser estos muy activos en su capacidad de multiplicarse y mutar adquiriendo de paso, nuevas características tales como la posibilidad de infectar nuevas especies, evadir

13 las respuestas inmunes o bien generar persistencia y permanecer o “despertar” sorpresivamente en sus hospederos naturales. Adendum Como comencé diciendo los virus se encuentran en todos los ambientes y formas de vida y para la muestra un botón: el año anterior, 2004, un virus fue descubierto en una ameba; hubiese pasado desapercibido si no fuera por que su tamaño era alrededor de 800 nm! , más de dos veces el tamaño de los virus más grandes conocidos hasta la fecha! Y como si esto fuera poco, poseía no solo ADN si no también ARN!, desafiando una vez más, como ya es común para los virus, los paradigmas de su propia clasificación, así como en el pasado han ayudado a desvelar el funcionamiento molecular de la célula y han ayudado a comprender mejor otros principios fundamentales de la biología. Este ejemplo nos da una idea de la versatilidad que los virus, como forma de vida tienen sobre el planeta, y nos estimula a seguir aprendiendo con un interés renovado de las interacciones que juegan con nosotros como seres humanos y con todos los otros seres vivos con los que conformamos una red inevitable. Nota: esta mini-revisión representa un esfuerzo independiente del autor para condensar los conocimientos de la virología fundamental en un documento de fácil comprensión para los estudiantes de las ciencias agrarias que aún no han tenido contacto con la virología como ciencia. Esta basado en los conocimientos adquiridos de varias fuentes bibliográficas y electrónicas no especificadas y puede aun contener errores de edición, redacción y concepto de los que el autor se hace responsable y espera corregir con la retroalimentación de sus colegas y estudiantes. Este documento se ha generado, como se explica al comienzo, para beneficio de los estudiantes de los cursos básicos de microbiología como un apoyo didáctico sin tener que dejar de prestar atención en clase. Se sugiere sin embargo, que para aquellos interesados en ampliar conceptos o para los insatisfechos, ambiciosos, ávidos de conocimiento o quienes simplemente deseen resolver una duda, consulten el libro “Principios de virología” cuyo editor es el profesor Jorge Ossa. Este libro representa en buena medida la fuente principal y motivación que me animó a hacer esta síntesis. Lecturas recomendadas disponibles en la biblioteca de la ciudadela de Robledo 1) Principios de virología. Jorge Ossa L. 3ª ed. 2000 2) Sección de virología del Manual de Microbiología Veterinaria. S Vadillo, S. Prinz, E. Mateos. Editorial McGraw-Hill Interamericana. 2002.Madrid, España. 853 p. 3) Principles of virology. Flint, Enquist, Racaniello, Skalka. Second edition. 2004. 4) A concise review of veterinary virology. G. R. Carter, D.J. Wise y E.F. Flores (Eds). Accesible en Inglés y parcialmente en español en forma gratuita en el sitio de la red del International Veterinary Information Service: http://www.ivis.org/