CENTRO DE ESTUDIOS Y CONTROL DE CONTAMINANTES CESCCO
UNIDAD DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL Y DE ALIMENTOS Investigación Aislamiento e Identificación de Salmonella sp., Shigella sp. y Listeria monocytogenes en quesos artesanales distribuidos en el Municipio Distrito Central, Honduras
Elaborado por: Ana Coello, Practicante de Microbiología UNAH Asesor Dr. Víctor Manuel Pineda, Jefe de la Unidad de Microbiología CESCCO
Junio- Agosto 2015
Agradecimientos Primeramente agradecer a Dios por permitirme presentar los resultados de dicha investigación la cual me ha permitido fortalecer mi carrera profesional. Agradecer a mi asesor el Dr. Víctor Pineda por brindarme la oportunidad de realizar este trabajo confiando en mi como profesional y dándome el apoyo compartiendo su conocimiento, por tener la paciencia de responder siempre mis interrogantes, le admiro mucho por su profesionalismo y dedicación. A la Dra. Lourdes Enríquez de Madrid por su apoyo y confianza. A la Dra. Gabriela Cárcamo por participar por de lleno en la investigación, por compartir sus conocimientos y tomar la responsabilidad de realizar dicho trabajo junto a mí y hacerlo de manera satisfactoria, se le agradece mucho su apoyo, tomando su participación como punto clave para poderse llevar a cabo dicho estudio. A la Técnico Nadia Zuniga por su apoyo incondicional, por su participación en diferentes actividades y su disponibilidad, gracias por sus palabras de esperanza siempre confiando en que todo saldrá bien.
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A la Auxiliar Leticia Canales por su ayuda y participación en las actividades asignadas de la mejor manera y siempre tomar la iniciativa para brindarnos su apoyo. Se le agradece al Señor Walter Castillo por brindarnos su apoyo y amabilidad al trasladarnos a cada sitio de muestreo Al señor Ramón Betancourt por su valiosa colaboración y apoyo en la realización de los muestreos en el Distrito Central. En general agradecer a toda la Unidad de Microbiología por permitirme formar parte de este gran equipo de trabajo, gracias por brindarme su apoyo y la gran amistad que llevare conmigo siempre.
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Reconocimiento
El desarrollo de dicha investigación fue posible gracias al apoyo brindado por el Departamento de Regulación Sanitaria por su participación en la realización de los diferentes muestreos, también se reconoce el apoyo de la Escuela de Microbiología brindando
materiales para análisis de laboratorio y por ultimo a la Unidad de
Microbiología CESCCO por su arduo trabajo en la realización de las diferentes etapas de dicha investigación.
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Índice de cuadros Cuadro 1. Productores de leche por región (3) ...................................................................... 19 Cuadro 2. Estimación de la incidencia reportada con agente causal conocido en Honduras .............................................................................................................................................. 23 Cuadro 3. Cronograma de recolección de muestras ............................................................ 33 Cuadro 4. Referencias metodológicas de análisis Manual BAM, FDA .............................. 35 Cuadro 5. Equipo y materiales de recuentos de indicadores de contaminación .................. 35 Cuadro 6. Equipo y materiales para determinación de patógenos ....................................... 36 Cuadro 7. Condiciones sanitarias evaluadas durante el muestreo ....................................... 42 Cuadro 8. Porcentaje de las condiciones sanitarias evaluadas ............................................ 43 Cuadro 9. Criterios microbiológicos para la inocuidad de alimentos (6) ............................. 43
Índice de tablas Tabla 1. Resultados de Recuento de indicadores de contaminación ................................... 44 Tabla 2. Resultado de Determinación de microorganismos patógenos ............................... 45
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Índice de gráficos
Grafico 1. Proporción de hogares con consumo de quesos, leche y crema según región . 12 Grafico 2. Proporción de hogares con consumo de quesos, leche y crema, según nivel de pobreza.................................................................................................................................. 13 Grafico 3. Porcentaje de muestras de acuerdo a su origen ................................................. 42 Grafico 4. Resultado de recuento de Coliformes totales .................................................... 47 Grafico 5. Porcentaje de resultados de recuento de Coliformes totales ............................. 47 Grafico 6. Resultado de recuento de Escherichia coli ........................................................ 48 Grafico 7. Porcentaje de resultados de recuento de Escherichia coli ................................. 48 Grafico 8. Resultados de recuento de Staphylococcus aureus ........................................... 49 Grafico 9. Porcentaje de resultado de recuento Staphylococcus aureus ............................ 49
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Índice de anexos Anexo 1. Formatos para la evaluación de las condiciones sanitarias de los sitios de muestreo .. 57 Anexo 2. Evaluación de las condiciones sanitarias en los locales comerciales ........................... 58 Anexo 3. Determinación de Salmonella sp. ................................................................................. 60 Anexo 4. Determinación de Shigella sp. ...................................................................................... 61 Anexo 5. Determinación de Listeria monocytogenes .................................................................. 62 Anexo 6. Recuento de Coliformes totales y Escherichia coli ...................................................... 63 Anexo 7. Recuento de Staphylococcus aureus ............................................................................ 63
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Índice de contenido 1.
Resumen ........................................................................................................................ 10
2.
Justificación ................................................................................................................... 11
3.
Antecedentes ................................................................................................................. 16
4.
Objetivos ....................................................................................................................... 18
Objetivo General................................................................................................................... 18 Objetivos específicos ............................................................................................................ 18 5.
Marco teórico ................................................................................................................ 19 5.1 Sector lácteo ............................................................................................................... 19 5.2 Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA’s) ................................................. 21 5.2.1 Estadísticas a nivel global ....................................................................................... 21 5.2.2 Las estadísticas en la región latinoamericana y del caribe ...................................... 22 5.2.3 Enfermedades Trasmitidas por Alimentos en Honduras ......................................... 22 5.3 Descripción de los microorganismos evaluados en el estudio ................................... 24 5.3.1 Indicadores de contaminación ................................................................................. 24 5.3.2 Coliformes Totales .................................................................................................. 25 5.3.3 Staphylococcus aureus ............................................................................................ 25 5.3.4 Escherichia coli ...................................................................................................... 26 5.3.3 Listeria monocytogenes ........................................................................................... 28 5.3.4 Salmonella sp. ......................................................................................................... 29 5.3.5 Shigella sp. .............................................................................................................. 30
6.
Material y métodos ........................................................................................................ 32 6.1
Instituciones Involucradas: .................................................................................... 32
6.2
Área de estudio ...................................................................................................... 32
6.3
Determinación de los Sitios de muestreo .............................................................. 32
6.4
Recolección de muestras ........................................................................................ 33
6.4
Toma de muestra .................................................................................................... 33
6.6
Análisis microbiológicos: ....................................................................................... 34
6.7
Diseño experimental: .............................................................................................. 34
6.7.1 Variables: ................................................................................................................. 34 6.8
Equipo y Materiales ................................................................................................ 35
6.9
Metodologías microbiológicas utilizadas .............................................................. 36
6.9.1 Recuento de Coliformes totales: .............................................................................. 36 6.9.2 Recuento de Escherichia coli .................................................................................. 37 Investigación CESCCO 2015 | Practica Profesional Supervisada
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6.9.3 Recuento de Staphylococcus aureus: ...................................................................... 37 6.9.4 Determinación de Salmonella sp. : .......................................................................... 38 6.9.5 Determinación de Shigella sp. : .............................................................................. 39 6.9.6 Determinación de Listeria monocytogenes: ........................................................... 39 7.
Resultados y discusión .................................................................................................. 41 7.1 Evaluación de las Condiciones Sanitarias de los Sitios de Muestreo ......................... 42 7.2 Evaluación Microbiológica......................................................................................... 43 7.3 Resultados de análisis microbiológicos ...................................................................... 44 7.4 Discusión .................................................................................................................... 49
8.
Conclusiones ................................................................................................................. 53
9.
Recomendaciones .......................................................................................................... 55
10. Referencias bibliográficas ............................................................................................. 56 11. Anexos ........................................................................................................................... 57
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1. Resumen El presente estudio fue realizado en el Municipio del Distrito Central, Francisco Morazán, Honduras, con el propósito de evaluar la calidad microbiológica de productos lácteos artesanales (Queso Fresco) como producto final distribuido en Mercados, Ferias y Puntos de ventas de lácteos. Realizando los análisis microbiológicos en el Laboratorio de Microbiología Ambiental y Alimentos del Centro de Estudios y Control de Contaminantes (CESCCO), en donde se analizaron un total de 40 muestras de quesos artesanales a las cuales se evaluó su calidad sanitaria mediante el Recuento de Coliformes Totales, Recuento de Escherichia coli, como indicadores de contaminación fecal y Recuento de Staphylococcus aureus, como indicador de manipulación, también se realizó la Determinación de patógenos
en alimentos Listeria monocytogenes, Shigella sp. y
Salmonella sp. Utilizando como referencia el Manual de Análisis Bacteriológico (BAM). Los resultados fueron comparados en base a lineamientos del Reglamento Técnico Centroamericano 67.04.50:08, 2009 solamente en el caso de Coliformes Totales se tomó el valor pauta del Reglamento de Leche y Productos Lácteos de Perú. En base a la comparación de los valores pauta referenciados se encontraron cargas elevadas de Coliformes totales incumpliendo en un 97.5% de las muestras, Escherichia coli en un 95% y Staphylococcus aureus en un 47.5%. En cuanto a la determinación de patógenos no se logró aislar Listeria monocytogenes, Salmonella sp. ni Shigella sp. a partir de la muestras analizadas.
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2. Justificación La determinación de microorganismos en los alimentos es de suma importancia dado que se considera la inocuidad como un factor que afecta la calidad en los productos alimenticios por eso toma importancia en el sector lácteo en Honduras ya que son particularmente importantes dado el futuro incierto de la industria de café y banano. El sector lácteo en nuestro país es el empleador rural más grande debido a que este contribuye a la subsistencia de más de medio millón de hondureños. También es la fuente más grande de ingreso de hondureños en áreas rurales. El sector lácteo está divido en dos dentro de los cuales se estima que del 100% de la producción de leche, 33% va destinada al sector industrial y el 67% al sector artesanal. Se menciona también que hay más de 625 plantas artesanales distribuidas en todo el país; los productos elaborados son y se estima que este circuito procesa 60% de la producción nacional. A pesar de ser un sector tan importante en la producción nacional, la leche que se utiliza en esto procesos no es de buena calidad, siendo muy irregular en su higiene, pues no hay control sanitario en los sitios de ordeño, generando quesos de muy variada y deficiente calidad. Además, no existe una estandarización para los productos, por tratarse de microempresas aisladas entre sí las unas de las otras con volúmenes de producción altamente variables. En cuanto al consumo de los productos lácteos en nuestro país estos han sido incluidos dentro de estudios importantes como ser la Encuesta Nacional de Condiciones de Vida 2004 la cual realizo un estudio basado en el Análisis de la Situación Alimentaria de Honduras divido en tres regiones Central, Occidental y Oriental en el cual se tomaron en
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cuenta los siguientes aspectos referidos al área de residencia, nivel de pobreza y tamaño de hogar con el propósito de analizar la disponibilidad de alimentos a nivel de hogar. En las tres regiones hay consumo de productos lácteos, en la región central es mayor el consumo y en la occidental es menor. (4)
Grafico 1. Proporción de hogares con consumo de quesos, leche y crema según región
Fuente: Análisis de la Situación Alimentaria en Honduras, ENCOVI 2004 (4)
Los quesos son los productos lácteos de mayor consumo en las tres regiones, en la central es usado por más del 80% de los hogares y en las otras dos regiones por más del 65%. La leche fluida y la crema son usadas por cerca del 65% de hogares en la región central y por el 55% en la oriental; la proporción de hogares que usa estos productos se reduce a 30% en la región occidental. Cuando se analiza el consumo de lácteos por nivel de pobreza de los hogares puede verse que la proporción de hogares que usan estos productos es bastante similar en los hogares no pobres (HNP) y hogares pobres HP, ligeramente mayor en los HNP.
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En cambio la proporción de los hogares clasificados en extrema pobreza (HExP) con consumo de estos productos es muy inferior a la reportada en los otros dos niveles, principalmente en crema y leche.
Grafico 2. Proporción de hogares con consumo de quesos, leche y crema, según nivel de pobreza
Fuente: Análisis de la Situación Alimentaria en Honduras, ENCOVI 2004
(4)
El queso es un producto bastante usado, tanto que la proporción de hogares que lo usan es de 65% en los HPEx, lo que insinúa que es un alimento de uso frecuente. Según los datos obtenidos se concluye que independiente de la región y nivel de pobreza, los productos de origen animal más usados son los huevos, los quesos también son frecuentes, aún en los hogares catalogados como en extrema pobreza. En el sector lácteo existen variadas razones para preocuparse por elementos de calidad y ambiente debido a que no existe un control de calidad periódico y continuo de estos productos, de tal manera que se pueda garantizar a la población que el producto que adquiere esté libre de algún grado de contaminación.
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Dentro de los principales centros de distribución de productos lácteos artesanales están: bodegas, mercados, supermercados, pulperías y vehículos repartidores, estos sitios en general, comercializan quesos sin madurarse. Igualmente más de la mitad de los locales comerciales en el país no poseen registro sanitario, indicando deficiencias en el control gubernamental. La temperatura ambiental, la mala manipulación, la falta de limpieza de los recipientes entre distintos lotes y otras condiciones de venta desfavorables facilitan el desarrollo de microorganismos, incluyendo los microorganismos patógenos. Por estas razones se determinaron este tipo de locales comerciales para realizar los muestreos durante el estudio. Dentro de los productos lácteos, los quesos artesanales son mayormente asociados a brotes e intoxicaciones alimentaria debido a que son considerados alimentos de alto riesgo por su alto contenido nutricional y porque en algunos países como el nuestro son elaborados de manera artesanal, es decir, no cuentan con un control de calidad que garantice su inocuidad, debido a esto se encuentra categorizado según el Reglamento Técnico Centroamericano como alimento con riesgo “Tipo A” los cuales de acuerdo a su procesamiento pueden ser dañinos para la salud. En Honduras existen pocos estudios sobre las enfermedades transmitidas por alimentos, los escasos datos de los casos reportados, revelan que el 98.9%
de las infecciones
gastrointestinales en Honduras son asociadas a origen bacteriano y el 1% es de origen viral y parasitario. Dentro de los patógenos más frecuentes según estadísticas de los casos en el país se encuentran Salmonella sp., Shigella sp. y Listeria monocytogenes.
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Es de mucha importancia que las instituciones involucradas en la problemática de las enfermedades transmitidas por alimentos realicen este tipo de estudios con el fin de fortalecer los sistemas de control de calidad que garanticen la inocuidad de los alimentos elaborados en nuestro país.
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3. Antecedentes El estudio de las causas de las enfermedades originadas por la ingestión de alimentos de consumo popular y su incidencia sobre la población no han recibido suficiente atención dentro del contexto social y económico del país, los antecedentes, respecto a esta problemática se limitan como consecuencia del manejo inadecuado de toda la cadena de producción de alimentos, el verdadero origen de múltiples patologías entéricas e intoxicaciones alimentaria pasa desapercibido, sin embargo, algunos estudios han logrado documentar ciertos problemas en la cadena alimentaria y a partir de estos se estimó que los alimentos más asociados a enfermedades transmitidas por alimentos son los lácteos, cárnicos y el agua de consumo. Dentro de estudios llevados a cabo por un grupo de investigadores llegaron a la conclusión que los factores que afectan la inocuidad de los productos lácteos comercializados en los mercados de Tegucigalpa fueron las prácticas de ordeño, el tiempo de almacenamiento de la leche, la limpieza del equipo y las condiciones de procesamiento, transporte y venta. También se determinó que entre los productos estudiados, el queso fresco presentó los niveles más altos de contaminación. (1) Según estudios previos del CESCCO en productos lácteos artesanales realizados en la ciudad de Tegucigalpa
(2)
se obtuvieron datos donde evidencia que un 97.2% de los
vendedores almacenan sus productos a temperatura ambiente, un 63.2% no disponen de servicio sanitario y en un 47.1% se observó la presencia de moscas; estos entre otros, son algunos factores que pueden estar contribuyendo a aumentar aún más el grado de
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contaminación de los productos en los mercados. Dentro de los resultados encontrados los productos lácteos de origen artesanal analizados no cumplían con los valores de referencia para Coliformes y Staphylococcus aureus
excediendo los valores permisibles, lo que
demostró el alto grado de contaminación bacteriológica, siendo esto un riesgo para la salud de los consumidores, según el estudio se demostró que el queso fresco y el queso seco presentaban mayor contaminación y riesgo. (2)
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4. Objetivos
Objetivo General
Determinar la calidad Higiénico-Sanitaria de productos lácteos que se distribuyen en los principales mercados y sitios estratégicos del Municipio del Distrito Central, y evaluar el riesgo que implican para la salud de los consumidores.
Objetivos específicos
Dar a conocer los factores que permiten el desarrollo de estos microorganismos durante el almacenamiento y distribución de estos productos.
Conocer la calidad microbiológica mediante el recuento de microorganismo indicadores de contaminación en los productos lácteos que son distribuidos en diferentes centros de venta del municipio del Distrito Central.
Determinar la presencia o ausencia se microorganismos patógenos Listeria monocytogenes, Salmonella sp. y Shigella sp. en los productos lácteos que son distribuidos en diferentes centros de venta del municipio del Distrito Central.
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5. Marco teórico
5.1 Sector lácteo En los últimos años Honduras se ha convertido en un importante productor de leche en el ámbito regional; La cadena de los productos lácteos, es una actividad relevante, tanto desde el punto de vista económico como social y con fuertes implicaciones en aspectos ambientales. Honduras es miembro del Tratado Multilateral de Libre Comercio e Integración Económica Centroamericana; además, está enmarcado dentro del proceso de apertura mediante la participación en el Tratado de Libre Comercio (TLC) entre los países del CA-3 (Guatemala, Honduras y El Salvador) y México, al igual que en otros tratados, lo cual implica serios desafíos para el sector. Según el Análisis de la Cadena de los Productos Lácteos el sector está divido en dos tipos de mercado industrial y artesanal en los cuales 33% del volumen total de producción de leche se vende a plantas industriales y el 67% del volumen total se vende al sector de las queserías artesanales. Los productores de leche en el país está divido en dos trópicos según la región en donde la mayor parte de las plantas industriales se ubican en el Trópico Húmedo y en el caso de las queseras artesanales, la mayoría se encuentran en el Trópico Seco.(3) Cuadro 1. Productores de leche por región (3) Productores de leche por región Región
Departamento
Porcentaje de distribución Industrial
Trópico húmedo
Trópico seco
Atlántida Cortes Yoro Olancho
80% se ubican en el Trópico Húmedo 20% se ubican en el Trópico Seco
Artesanal 30% se ubican en el Trópico Húmedo 70% se ubican en el Trópico Seco
Fuente: Análisis de la Cadena de los Productos Lácteos en Honduras IICA, 2001
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Dentro del Análisis de la Cadena de Productos Lácteos se observaron ciertas limitante que entre ellos la situación de infraestructura ya que es crítica en las queserías artesanales, con situación de emergencia en cuanto a tanques de enfriamiento, pilas de acero inoxidable y pasteurizadoras prácticamente en el 100% de las queserías que no exportan y en el 50% de las que exportan, en cambio las plantas industriales no tienen punto de comparación con las plantas artesanales, ya que éstas cuentan con infraestructura más compleja como ser: tanques de enfriamiento, pilas de acero inoxidable, pasteurizadoras, descremadoras, marmitas, uso mínimo de tambos plásticos (solo en el 25% de las plantas), ya que se utilizan más los yogos metálicos. En las queserías artesanales (con excepción de algunas que exportan) se dan las siguientes condiciones:
Existe poco o nulo control de calidad de la leche recibida ya que carecen de métodos para analizar la composición de la leche y determinar los porcentajes de sólidos, agua y grasas presente en la leche.
Los implementos en la recolección de leche a las fincas de los productores son de plásticos y el malo o poco control de higiene de éstas, puede aumentar la proliferación de bacterias al momento de recibir la leche. Poco o nulas condiciones higiénicos sanitarios presentes en el procesamiento de productos lácteos. Carencia de equipos de uso personal (gorras, gabachas, botas, guantes, boquillas) para la manipulación de la leche desde el recibo-proceso-producto terminado.
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Carencia de áreas para preservar a condiciones adecuadas los productos elaborados y libres de todo agente (perros, gatos, roedores, insectos, etc.).
Por estas razones la capacidad de las agroindustrias para fortalecer la permanencia de la cadena de los productos lácteos en el mercado en forma duradera, es más clara en las empresas industriales, las cuales son modernas y están en mejores condiciones para hacerle frente a los desafíos de la competitividad. Lo que corresponde a las pequeñas agroindustrias, cuyas condiciones de infraestructura son en muchos casos lamentables y por ende, todo lo relacionados con los resultados técnicos y económicos de su gestión, incluyendo los temas de la calidad y la inocuidad de los productos que fabrican. Por eso en el marco de un plan estratégico para el mejoramiento de la competitividad de la cadena Láctea en Honduras, la modernización y transformación de estas empresas podría ser un asunto prioritario. A nivel de las agroindustrias artesanales, será necesario trabajar en iniciativas y proyectos. (2)
5.2 Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA’s) 5.2.1 Estadísticas a nivel global De los 1,500 millones de casos de la enfermedad diarreica aguda se asume que aproximadamente 70% de los casos son causados por el consumo de agua o de alimentos contaminados, según los cálculos de la OMS, no obstante, es difícil obtener una imagen exacta de la incidencia de ETA a nivel mundial (OPS, 2005).(5)
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5.2.2 Las estadísticas en la región latinoamericana y del caribe Hay que recordar las limitaciones en la cobertura y la calidad de los sistemas de vigilancia epidemiológica y las diferencias geográficas en América Latina. El siguiente es un resumen del reporte al sistema de información de OPS para la vigilancia de ETA (SIRVETA) durante los últimos nueves años. SIRVETA recibió 6,511 informes de brotes ETA de 22 países de la Región, Cuba contribuyó con más del 54% de los informes totales. Cerca de 250,000 personas se enfermaron y 317 personas murieron. 37% de los brotes sucedieron en casa. El 29% de los brotes no tuvieron ningún tipo de análisis de laboratorio 5 para identificar el agente causal. Entre los casos de etiología confirmada 57% se atribuyeron a bacterias, 12% a los virus y 21% a las toxinas marinas. Los restantes 10% fueron causados por parásitos, contaminantes químicos o las toxinas de plantas. Los productos alimenticios más comúnmente asociados fueron: peces (22%), agua (20%) y carnes de ganado (14%). (5)
5.2.3 Enfermedades Trasmitidas por Alimentos en Honduras En nuestro país la evaluación de la calidad de los productos alimenticios destinados al consumo humano han estado limitadas al análisis de ciertas bacterias y con más énfasis en productos destinados a la exportación. Por el contrario los productos de tipo artesanal, listos para el consumo no reciben ningún tipo de control por parte del gobierno, más que estudios esporádicos, dirigidos a evaluar la contaminación de tipo microbiológico por medio de la detección y recuento de microorganismos indicadores, que en suma no revelan el riesgo potencial a la salud ya que no detectan la mayoría de bacterias involucradas en
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enfermedades transmitidas por alimentos (ETA´s). Dentro de los casos reportados en Honduras de 1998 a 2006 excepto (2001) el 98.9% de los casos son de origen bacteriano, el 1% de origen viral y casos por parásitos y agente químicos incluyendo toxinas bacterianas no alcanzan el 0.1%. Siendo así las enfermedades transmitidas por alimentos son una de las principales causas de diarreas según la Organización Panamericana de la Salud, el 64% de las intoxicaciones e infecciones por alimentos en Latinoamérica son causados por bacterias como Salmonella sp., Escherichia coli O157:H7 y Listeria monocytogenes. (1) Dentro de los pocos estudios que se realizan en nuestro país se ha logrado estimar la incidencia de las enfermedades transmitidas por alimentos para la población de Honduras dando a conocer datos importantes en esta problemática basado en datos estadísticos del Instituto Hondureño de Seguridad Social y de la Secretaría de Salud.
Cuadro 2. Estimación de la incidencia reportada con agente causal conocido en Honduras
Fuente: Enfermedades transmitidas por alimentos y su impacto socioeconómico estudios de caso en Costa (1) Rica, El Salvador, Guatemala, Honduras y Nicaragua FAO, 2009
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Entonces, sólo a partir de la aplicación de una metodología de muestreo, análisis de laboratorio e identificación de centros de producción; se podrá determinar la calidad de éstos derivados de leche que se consumen; ello implica que exista interés por el Gobierno para poder establecer programas, acciones, actividades y normas que conduzcan a mejorar las condiciones alimentarias con la responsabilidad.
5.3 Descripción de los microorganismos evaluados en el estudio 5.3.1 Indicadores de contaminación La detección en el laboratorio de los microorganismos patógenos puede ser muy complicada, muy lenta y/o muy costosa para determinaciones rutinarias. Además, es concluyente cuando se encuentra un microorganismo patógeno pero puede haber casos en que no se detecte por razones circunstanciales como el clima o la cantidad de individuos infectados que están contaminando, a pesar de que el manejo del alimento implique el riesgo de que el patógeno aparezca en cualquier momento. En todo caso, la investigación de microorganismos patógenos en alimentos no facilita un enfoque preventivo. Por esas razones, las normas en materia de alimentos, generalmente establecen la calidad microbiológica en términos de microorganismos indicadores. Éstos son organismos (o grupos) que advierten oportunamente de un manejo inadecuado o contaminación que incrementan el riesgo de presencia de microorganismos patógenos en alimentos. Además de que su detección en el laboratorio es más sencilla, rápida y/o económica, los microorganismos indicadores permiten un enfoque de prevención de riesgos, puesto que advierten manejo inadecuado y/o contaminación.
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5.3.2 Coliformes Totales Los Coliformes Totales producen, para fermentar la lactosa, la enzima β-galactosidasa. Tradicionalmente, se consideraba que las bacterias Coliformes pertenecían a los géneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter. El grupo de los Coliformes totales incluye microorganismos que pueden sobrevivir y proliferar en el agua. Por consiguiente, no son útiles como índice de agentes patógenos fecales, pero pueden utilizarse como indicador de la eficacia de tratamientos y para evaluar la limpieza e integridad de sistemas de distribución y la posible presencia de biopelículas. (7) 5.3.3 Staphylococcus aureus El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos, tiene gran importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina, que al ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre. Staphylococcus aureus produce 5 enterotoxinas las cuales son: A, B, C, D y E, siendo la “A” la más nociva. La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente toxina para causar intoxicación (1.0 microgramo), es de 106 UFC/g de alimento, esto de acuerdo con las Norma Mexicanas, sin embargo Jablonski et al, comentan que el FDA, establece que una cantidad de Staphylococcus aureus patógeno, en el que se encuentren 105 UFC/g de alimento, provoca intoxicaciones y que un nivel basal de aproximadamente un nanogramo de toxina estafilocócica por gramo de alimento, es suficiente para causar síntomas asociados con la intoxicación antes mencionada. También es importante observar, que en la mayoría de los brotes de intoxicación causados por este microorganismo, se han detectado niveles de uno a cinco microgramos de toxina ingerida, aunque en algunos casos las concentraciones de toxina han
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sido aún más bajas, del orden de 0.01 microgramo, suficientes para provocar una intoxicación en el hombre. Los alimentos contaminados con esta cantidad de bacterias, no presentan ninguna diferencia perceptible en cuanto a su apariencia, sabor y olor, por lo que no se distinguen de los alimentos que no están contaminados con este microorganismo, por esta razón el peligro de ingerir alimentos contaminados con Staphylococcus aureus sin darse cuenta es alto. Los alimentos sometidos a intensa manipulación durante su preparación y que se mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 72°C y por debajo de 60°C) después de su preparación, son los alimentos más involucrados en la intoxicación estafilocócica. (8)
En la actualidad se identifican más de 200 enfermedades transmitidas por medio del consumo de alimentos, reconocidas como enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). Las ETA se continúan presentando en brotes y con frecuencia el microorganismo identificado suele ser S. aureus. Similar a lo encontrado en este brote, se ha descrito que el S. aureus se manifiesta a las pocas horas desde el consumo y el cuadro clínico desarrollado por los afectados es predominantemente gastrointestinal con náuseas, vómitos, dolor abdominal y menos frecuentemente, diarrea. La insalubre manipulación de alimentos como carnes, embutidos y lácteos por parte del personal en fábricas, guarderías, negocios de comidas y en casa, son factores de riesgo asociados a las ETA. (8)
5.3.4 Escherichia coli Es un bacilo Gram-negativo, residente del intestino de animales de sangre caliente. Por mucho tiempo se utilizó a este microorganismo como un indicador de la sanidad de los alimentos, pero luego se descubrió la existencia de cepas capaces de causar enfermedades Investigación CESCCO 2015 | Practica Profesional Supervisada
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entéricas. En efecto, este tipo de E. coli, es ahora conocida como el agente etiológico causal de diarrea y enfermedades gastrointestinales en países en desarrollo y en otras áreas con pobres condiciones sanitarias. Algunos serotipos de E. coli pueden sobrevivir a períodos prolongados de refrigeración pero son muy sensibles a inactivación por calor. La refrigeración de carnes pre-cocidas se ha identificado como una forma de manejo eficiente para reducir el riesgo de infección por este microorganismo. Los síntomas varían significativamente y dependen del tipo de E. coli patogénico donde cuatro tipos han sido identificados: E. coli entero-patogénicas (EPEC): causan un repentino ataque con severos calambres abdominales, postración de la persona y diarrea sanguinolenta. E. coli entero-toxigénicas (ETEC): produce toxinas que causan de una leve a severa diarrea con profunda deshidratación y conmoción sin fiebre. Ciertas toxinas termolábiles y termo-estables pueden ser encontradas en este tipo. E. coli entero-invasiva (EIEC): penetra el epitelio y causa fiebre, escalofrío, dolor de cabeza, dolores musculares, calambres abdominales, y una diarrea pálida y profusa. E. coli entero-hemorrágica (EHEC): causa cambios en el colon, similares a los de colitis. La verocitotoxina es el agente causal y resulta en una diarrea sanguinolenta y severos dolores abdominales. En algunos casos puede producir el Síndrome hemolítico urémico. Puede presentarse vómito y el síndrome usualmente demora siete días en adultos pero es más largo en niños. (9)
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5.3.3 Listeria monocytogenes Es un bacilo Gram-positivo no esporulado. Listeria monocytogenes es una bacteria telúrica, muy extendida en el ambiente. Es muy resistente al medio exterior, pudiendo sobrevivir varios años a 4ºC. Es huésped de seres vivos, encontrándose de 5 a 30% en el intestino de los animales y humanos. L. monocytogenes es una bacteria que se desarrolla bien entre los 2.5 y los 4ºC. La congelación (-15ºC) no la destruye pero sí detiene su crecimiento. Es resistente a medios ácidos por lo que su crecimiento puede darse a pH bajo. Tiene también cierta resistencia a los nitritos, pero puede ser destruida por medio de la pasteurización. Es anaerobia facultativa. Es el agente causante de la Listeriosis, enfermedad común en el hombre y en numerosas especies animales. Es responsable de producir abortos, septicemias y meningitis. La infección se produce esencialmente por vía digestiva. Las personas más sensibles son las mujeres embarazadas, los recién nacidos, las personas de edad avanzada y los que hayan tenido una disminución de sus defensas inmunológicas como los enfermos de cáncer, leucemia, diabetes y ciertas enfermedades renales. Todos los alimentos son potencialmente sospechosos. Particularmente, los vegetales crudos, las carnes rojas, pescado, salsas, leche entera, leche con chocolate, quesos blandos, quesos fermentados, productos lácteos que no han recibido un proceso de pasteurización y todos los alimentos que se comercializan listos para consumir. Está muy bien establecido que cualquier producto fresco de origen animal o vegetal puede albergar un número variable de L. monocytogenes. La prevalencia de este organismo en leche y productos lácteos ha recibido atención debido a brotes epidémicos.
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En un estudio realizado en Holanda en 1988, 4.6% de 829 muestras de queso blando elaborados a partir de leche cruda fueron positivas para Listeria monocytogenes (Jay, 2000). L. monocytogenes es muy importante en alimentos congelados listos para consumir, por esta razón se ha buscado métodos para identificar y aislar este microorganismo. Su aislamiento es particularmente difícil en el caso de alimentos que tienen una alta contaminación con otros microorganismos lo que usualmente lleva a una inadecuada siembra de este patógeno. (9) La presencia de Listeria depende de muchas variables, su presencia no es normal en los animales aunque en ellos es un patógeno más frecuente que en el ser humano, así que el manejo del ganado, las condiciones ambientales, las prácticas de manufactura, el transporte, el almacenamiento y las condiciones de venta inciden en la presencia de esta en el producto que se expende. 5.3.4 Salmonella sp. Es un bacilo Gram-negativo, no esporulado, generalmente móvil debido a los flagelos periféricos, aunque pueden existir cepas inmóviles. La temperatura óptima de crecimiento en condiciones experimentales es de 37°C. El pH del substrato, así como el tiempo de incubación, influyen en la temperatura de crecimiento, éstas se dan a un pH de 7 a 8. El mayor reservorio de esta bacteria, es el tracto intestinal de los animales. Salmonella puede permanecer en muchos alimentos debido a su simple requerimiento nutricional y a la gran habilidad para crecer en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Sin embargo este microorganismo tiene un amplio rango de pH y temperatura a la cual pude sobrevivir.
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Los alimentos asociados con esta bacteria son: carnes crudas, leche y productos lácteos, pescado, camarones, aves de corral, huevos, ensaladas, coco, cacao, chocolate. Otros 10 alimentos relacionados con este patógeno son: ensaladas, sándwiches, bocaditos de carne y salsas recalentadas. Salmonella es encontrado en una gran variedad de productos cárnicos debido a la contaminación cruzada que se puede dar por la inadecuada desinfección de los equipos y utensilios utilizados en el proceso de estos productos. La enfermedad causada por esta bacteria se llama Salmonelosis, pero existen tres tipos de esta enfermedad: Fiebre entérica, gastroenteritis y septicemia. (9) Los serotipos de Salmonella más representativos a nivel mundial son S. enteritidis y S. typhimurium (24,1% y 6,6% de los brotes son atribuidos a estos serovares respectivamente); ubicándose así como el principal microorganismo bacteriano implicado en el 46,9% del espectro de las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA), seguido del Staphylococcus aureus, gracias a su extraordinaria capacidad de colonización y adaptación a diversos hospederos animales, donde las aves cumplen un papel protagónico.(11)
5.3.5 Shigella sp. El género Shigella está formado por bacilos Gram-negativos inmóviles, anaerobios facultativos no esporulados, pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Presentan actividad bioquímica reducida con actividad citocromo-oxidasa negativa y fermentación de glucosa sin producción de gas.
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Las especies de Shigella son muy sensibles a fluctuaciones de temperatura y a condiciones ambientales desfavorables. Sin embargo, son tolerantes a pH bajos, por lo que unas pocas bacterias pueden soportar la acidez del estómago y luego colonizar el tracto digestivo. Esta facultad, sumada a que son infectivas a bajas dosis, contribuye a su patogenicidad. Las principales especies del género Shigella son las siguientes: Shigella sonnei, Shigella flexneri, Shigella boidy, Shigella dysenteriae. Los alimentos comúnmente asociados a la transmisión de la enfermedad son:
Agua de consumo de fuente no segura, por ejemplo, agua de pozo contaminada por pozos ciegos, o agua de lagos o ríos sobre los que se vierten aguas residuales
Verduras y frutas provenientes de huertas donde se utilizan aguas servidas para riego.
Comidas que requieren mucha manipulación, que se sirven frías sin proceso de cocción y que ante falta de higiene del elaborador pueden contaminarse: ensaladas con ingredientes varios, vegetales crudos, lácteos y aves.
La infección por Shigella afecta a la porción distal del intestino delgado y al intestino grueso. Se caracteriza por diarrea acompañada de fiebre, náuseas y a veces vómitos, cólicos y tenesmo (inflamación del intestino que causa sensación de necesidad de defecar aunque los intestinos estén vacíos, acompañado de dolor cólico). En los casos característicos, las heces contienen sangre moco (disentería), como consecuencia de la aparición de úlceras en la mucosa y micro abscesos confluentes en las criptas del colon. Las convulsiones pueden ser una complicación importante en niños de corta edad.
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6. Material y métodos:
6.1 Instituciones Involucradas:
Secretaria de Energía, Recursos Naturales, Ambiente y Minas “Mi Ambiente+” a través del Centro de Estudios y Control de Contaminantes “CESCCO”
Escuela de Microbiología de la Universidad Nacional Autónoma de Honduras (UNAH)
Departamento de Regulación Sanitaria de la Región Metropolitana, Secretaria de Salud.
6.2 Área de estudio El Municipio de Distrito Central (M.D.C.) el cual es uno de los 28 municipios que conforman el departamento de Francisco Morazán, uno de los 18 departamentos que juntos poseen los 298 municipios que conforman la República de Honduras. El área total del Municipio Central es de 1396 km² con una población de 1, 300,000 habitantes (2014). El área administrativa del Distrito Central está formada por un sector urbano denominado el Área Metropolitana de Tegucigalpa y Comayagüela, el cual está divido en 892 barrios y colonias, así como también un sector rural que posee 44 aldeas y 291 caseríos.
6.3 Determinación de los Sitios de muestreo La determinación de los sitios de muestreo se hizo en conjunto con el Departamento de Regulación Sanitaria por medio de personal encargado del control y vigilancia sanitaria de los registros sanitarios emitidos. Para llevar a cabo la investigación se seleccionaron diferentes sitios de muestreo en donde se encuentran actividades de venta de productos Investigación CESCCO 2015 | Practica Profesional Supervisada
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lácteos artesanales que tienen alta demanda por la población, el total de las muestras recolectadas fueron tomadas directamente de los locales comerciales (Mercados, ferias, distribuidoras y ventas de lácteos) todos estos ubicados en el Municipio del Distrito Central 6.4 Recolección de muestras La recolección de las muestras fue realizada entre los meses de Junio y Julio del año 2015, siguiéndose una programación de 4 semanas en las cuales se colectarían 10 muestras por semana de muestreo, haciendo un total de 40 muestras en los cuatro muestreos realizados.
Cuadro 3. Cronograma de recolección de muestras
Muestreo 1er Muestreo 2do Muestreo 3er Muestreo 4to Muestreo
Año 2015 Junio
Julio
22 29 6 10
6.4 Toma de muestras El proceso de colecta de muestras fue realizado con el apoyo del Departamento de Regulación Sanitaria de la Secretaria de Salud de Honduras, las condiciones de colecta de las muestras fueron las mismas condiciones que cuentan los consumidores por lo que la manipulación del producto así como su empaque fueron facilitados por el locatario de establecimiento comercial, después de terminar cada muestreo las muestras fueron trasladadas de forma inmediata al Laboratorio de Microbiología Ambiental y de Alimentos CESCCO bajo condiciones de refrigeración. Los análisis se realizaron, dentro de las 08 horas posteriores a la colecta de las muestras. Investigación CESCCO 2015 | Practica Profesional Supervisada
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También se obtuvo información adicional necesaria para poder llevar el control de cada sitio de muestreo y posteriormente brindar los resultados obtenidos en la investigación, se llenó la plantilla de cada muestra con el nombre propietario, distribuidor, origen, fecha, hora de recolección y domicilio de acuerdo al formato emitido por la Unidad de Regulación Sanitaria. Adicionalmente se recolectaran datos en un registro, evaluando las condiciones higiénicosanitarias de los establecimientos, con la finalidad de tener evidencias de las probables fuentes de contaminación de estos productos, dicho registro contiene información básica en relación a infraestructura, higiene de las instalaciones, higiene de los productos e higiene de los manipuladores. 6.6 Análisis microbiológicos: Los análisis de calidad microbiológica se realizaron en el Laboratorio de Microbiología Ambiental y Alimentos CESCCO. 6.7 Diseño experimental: Se hizo un estudio descriptivo, mediante la detección de indicadores de contaminación como ser Coliformes Totales, Escherichia coli y Staphylococcus aureus también se hizo la determinación de microorganismos patógenos como Listeria monocytogenes, Salmonella sp. y Shigella sp. en muestra de queso fresco artesanal. 6.7.1 Variables: Tipo de muestra: Queso fresco Cantidad de muestra: Media libra Número total de muestras: 40 muestras
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Análisis microbiológicos: Los métodos analíticos se realizaron de acuerdo a lo establecido en el Bacteriological Analitycal Manual (BAM) de la Food and Drug Administration (FDA) según las últimas actualizaciones disponibles.
Cuadro 4. Referencias metodológicas de análisis Manual BAM, FDA
Parámetro
Capitulo BAM
Actualización
Cap. 4 Cap. 12 Cap. 5 Cap. 6 Cap. 10
Actualizado Febrero del 2013 Actualizado Mayo del 2014 Actualizado Febrero del 2013 Actualizado Mayo 2013
Recuento de Coliformes y E. coli Recuento de Staphylococcus aureus Salmonella Shigella Listeria monocytogenes
6.8 Equipo y Materiales Cuadro 5. Equipo y materiales de recuentos de indicadores de contaminación
Equipo Todos los parámetros Balanza capaz de pesar 25 ± 0.1g Frascos de dilución Stomacher Bolsas Stomacher Incubadoras de 35°C±0,5ºC Mezclador Vortex Tijeras, bisturí y pinzas estériles Asas en anillo y en punta Incinerador Placas de Petri 16 x100mm Propipeta Pipetas graduadas 10, 5 y 1 ml Tubos 13× 100mm con tapón de rosca Contador de colonias Lentes UV Lámpara de luz ultravioleta de onda larga (365nm
Materiales/Medios de cultivo y reactivos Escherichia coli Staphylococcus aureus
Coliformes totales
Agua peptonada 0.1% Agar VRBA Reactivos Tinción de Gram
Agua peptonada 0.1% Agar VRBA con MUG Reactivos Tinción de Gram
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Agua peptonada 0.1% Agar Baird Parker Solución yema de huevo con telurito de potasio 50% Agar soya Tripticasa Caldo soya Tripticasa Plasma de conejo con EDTA Peróxido de hidrógeno al 3%
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Cuadro 6. Equipo y materiales para determinación de patógenos
Equipo Todos los parámetros
Materiales/Medios de cultivo y reactivos Salmonella sp. Shigella sp. Listeria monocytogenes
Balanza capaz de pesar 25 ± 0.1g Stomacher Bolsas Stomacher Incubadoras de 30ºC± 0,2ºC Incubadoras de 35°C±0,5ºC Incubadora de 42ºC± 0,2ºC Incubadora de 43ºC± 0,2ºC Matraz Erlenmeyer de 500 ml Matraz Erlenmeyer de 250 ml Mezclador Vortex Tijeras, bisturí y pinzas estériles Incinerador Asas en anillo y en punta Microscopio óptico Portaobjetos Placas de Petri 16 x100mm Pipetas de 25, 10 y 1 ml Tubos 13 × 100 mm con tapón de rosca
Caldo Lactosado Caldo RV Caldo TT Agar XLD Agar BS Agar HE Agar Mc Agar TSA Agar TSI Agar LIA Agar MIO MicroGen (GNA+GNB)
Caldo GN Agar XLD Agar HE Agar Mc Agar TSA Agar TSI MicroGen (GNA+GNB)
Buffered Listeria Caldo de enriquecimiento Medio Oxford Cicloheximida La natamicina (pimaricina) Monoclorhidrato de Acriflavina Solución de peróxido de hidrógeno 3% Medio SIM Gelosa Sangre Caldo Ramnosa Caldo Manitol Caldo Glucosa Caldo Maltosa Caldo Xilosa Api Listeria
6.9 Metodologías microbiológicas utilizadas Generalmente, la cantidad exacta de microorganismos presentes en un alimento contaminado es desconocida, y el número de organismos detectables dependerá de las características del método utilizado. La mayoría de los métodos analíticos utilizados para la detección de microorganismos en alimentos están basados en el uso de cultivos selectivos. 6.9.1 Recuento de Coliformes totales: Siembra: Se pesaron 10 g de la muestras de queso y se diluyeron en 90 mL. de agua peptonada estéril 0.1%. Se realizaron diluciones decimales hasta 10ˉ6 en Agua peptonada estéril 0,1% y a partir de cada una se inocularon 1mL, por el método de vaciado en placa, Investigación CESCCO 2015 | Practica Profesional Supervisada
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luego se añadió Agar VRBA fundido y enfriado a 45ºC homogenizando con movimiento en ocho y dejando solidificar para su posterior incubación 35±0,5°C 24- 48 horas en atmósfera aerobia. Lectura: Colonias lactosa positivo, de color rojo intenso, con zona de precipitado de ácidos biliares, diámetro de 0,5 mm o mayor. Las placas deben tener entre 25-250 colonias. 6.9.2 Recuento de Escherichia coli Siembra: Se pesaron 10 g de la muestras de queso y se diluyeron en 90 mL de agua peptonada estéril 0.1%. Se realizaron diluciones decimales hasta 10ˉ6 en Agua peptonada estéril 0,1% y a partir de cada una se inocularon 1mL, por el método de vaciado en placa, luego se añadió Agar VRBA con MUG fundido y enfriado a 45ºC homogenizando con movimiento en ocho y dejando solidificar para su posterior incubación 35±0,5°C 24-48 horas en atmósfera aerobia. Las placas deben tener entre 25-250 colonias. Lectura: Después del periodo de incubación observar las colonias con la cámara de luz ultravioleta y contar las colonias que produzcan fluorescencia solamente. 6.9.3 Recuento de Staphylococcus aureus: Se pesaron 10g de la muestras de queso y se diluyeron en 90 mL de agua peptonada estéril 0.1%. Se realizaron diluciones decimales hasta 10ˉ3en Agua peptonada estéril 0,1% y a partir de cada una se inocularon 0,3 mL por el método de extensión en superficie en Agar Baird Parker para su posterior incubación 35±0,5°C 24 - 48 horas en atmósfera aerobia. Las placas deben tener entre 20-200 colonias.
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Lectura: Se consideraron sospechosas las colonias que presentaron una coloración negra y que fueran convexas, con reborde blanco y una zona de aclaramiento. Pruebas confirmatorias: Prueba de Coagulasa Prueba de Catalasa 6.9.4 Determinación de Salmonella sp. : Pre enriquecimiento: Se pesaron 25 g de cada muestra de queso y se homogeneizaron en 225 mL de Caldo Lactosado simple, el cual fue incubado por 24 ± 2h a 35 ± 0,5ºC. Enriquecimiento: A partir del Caldo de pre enriquecimiento, se transfirió 1 mL a Caldo Tetrationato, el cual fue incubado a 43 ± 0,2ºC por 24 ± 2h y 0.1mL de Caldo Rapapport Vasilliadis, el cual se incubó a 42 ± 0,2ºC por 24 ± 2h. Aislamiento selectivo: A partir de cada uno de los caldos de enriquecimiento, se realizó un aislamiento selectivo utilizando Agar Xilosa Lisina Desoxicolato y Agar Hecktoenentérico, incubados por 24±2h a 35 ± 0,5ºC. Purificación de colonias: A partir de las colonias sospechosas en los medios selectivos sembrar en un medio no selectivo TSA incubados por 24±2h a 35±0,5ºC para la obtención de colonias puras. Pruebas Bioquímicas: Las colonias sospechosas fueron sembradas en Agar TSI, Agar LIA y MIO, incubados por 24 ± 2h a 35 ± 0,5ºC. Identificación Bioquímica final: Para su confirmación se utilizó el sistema MicroGen-ID.
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6.9.5 Determinación de Shigella sp. : Enriquecimiento: Se pesaron 25 g de cada muestra de queso y se homogeneizaron en 225 mL de Caldo GN Hajna, el cual fue incubado por 24 a 48 horas a 35±0,5ºC. Aislamiento selectivo: A partir de cada del caldo de enriquecimiento de 24 y 48 horas, se realizó un aislamiento selectivo utilizando Agar Xilosa Lisina Desoxicolato y Agar Hecktoen-entérico y Agar MacConkey incubados por 24±2h a 35±0,5ºC. Purificación de colonias: A partir de las colonias sospechosas en los medios selectivos sembrar en un medio no selectivo TSA incubados por 24±2h a 35±0,5ºC para la obtención de colonias puras. Pruebas Bioquímicas: Las colonias sospechosas fueron sembradas en Agar TSI, incubados por 24±2h a 35±0,5ºC. Identificación Bioquímica final: Para su confirmación se utilizó el sistema MicroGen-ID 6.9.6 Determinación de Listeria monocytogenes: Pre enriquecimiento Se midió 25 g de cada muestra y se homogeneizaron en 225 mL de Caldo Buferado Listeria, el cual fue incubado a 30±0,2ºC por cuatro horas. Enriquecimiento selectivo: Después de las primeras cuatro horas de incubación se agregaron los suplementos selectivos y posteriormente se continuo con la incubación a 30±0,2ºC por 24 y 48 horas. Purificación de colonias: A partir de las colonias sospechosas en los medios selectivos, sembrar en un medio no selectivo TSA incubados por 24±2h a 35±0,5ºC para la obtención de colonias puras.
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Aislamiento selectivo: a partir del Caldo de enriquecimiento de 24 y 48 horas se realizó un aislamiento selectivo utilizando Agar Oxford, el cual se incubó por 24±2h a 35±0,5ºC. Lectura: Colonias sospechosas, redondas, café oscuras y con una depresión central. Pruebas bioquímicas: Fueron confirmadas mediante las pruebas de Gram, Oxidasa, Catalasa, Hemolisis, fermentación de Xilosa, Ramnosa, Arabinosa, Glucosa, Maltosa y movilidad en medio SIM a 25ºC.
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7. Resultados y discusión: El presente estudio se realizó durante un periodo comprendido entre Junio y Agosto del 2015 analizándose un total 40 muestras de quesos artesanales. Obteniéndose los siguientes resultados: En el proceso de la investigación se logró muestrear 40 locales comerciales de productos lácteos artesanales distribuidos en el Municipio del Distrito Central los cuales fueron Geo referenciados de la siguiente manera:
Figura 1. Sitio muestreados Geo referenciados en el Municipio del Distrito Central
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Grafico 3. Procedencia de muestras de acuerdo a su origen
7.1 Evaluación de las Condiciones Sanitarias de los Sitios de Muestreo Para brindar un producto final de calidad al consumidor, es necesario tener claro no sólo los factores higiénicos sanitarios, sino también los conocimientos sobre higiene y manipulación de alimentos del operario último, (manipulador), previo a ser adquirido por el consumidor. Por estas razones se evaluaron las siguientes características de manera individual en cada punto de venta de lácteos Se determinaron los aspectos higiénicos de acuerdo a las instalaciones, higiene del producto e higiene de los manipuladores en donde se obtuvieron los siguientes porcentajes de acuerdo al cumplimiento e incumplimiento de cada característica: Cuadro 7. Condiciones sanitarias evaluadas durante el muestreo Conservación/ Personal/ Almacenamiento Limpieza de la muestra No Si No Si 33 12 28 7 Total: 40 Total: 40 Cumple: Si /No cumple: No
Manipulación de la muestra Si No 9 31 Total: 40
Condiciones sanitaria del local Si 22
No 18 Total: 40
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Ubicación del producto Si No 25 15 Total:40
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Cuadro 8. Porcentaje de las condiciones sanitarias evaluadas
Porcentaje Cumple No cumple 17.5% 82.5% 30% 70% 22.5% 77.5% 55% 45% 62.5% 37.5%
Característica evaluada Conservación/ Almacenamiento de la muestra Personal/limpieza Manipulación de la muestra Condiciones sanitaria del local Ubicación del producto
7.2 Evaluación Microbiológica En el análisis de los resultados obtenidos se toma como referencia el Reglamento Técnico Centroamericano, en el que se plantean los criterios microbiológicos para la inocuidad de alimentos necesarios para el procedimiento de registro sanitario y vigilancia sanitaria de alimentos que requieren que se realicen análisis previos del producto, deberá cumplirse con las siguientes disposiciones. (6) Cuadro 9. Criterios microbiológicos para la inocuidad de alimentos (6) 1.9 Subgrupo del alimento: Quesos frescos, no madurados y requesón Parámetro Escherichia coli Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes/25g Salmonella sp./25g
Categoría 5 7 10 10
Tipo de riesgo A
Límite máximo permitido < 10 UFC/g 1000 UFC/g Ausencia Ausencia
Fuente: Reglamento Técnico Centroamericano 67.04.50:08, 2009
Para registro y vigilancia sanitaria se clasifican los alimentos basándose en la probabilidad de causar daño a la salud, la gravedad de dicho efecto, el queso fresco de acuerdo a tipo de riesgo se encuentra en Alimento Riesgo tipo A, el cual comprende los alimentos que por su naturaleza, composición, proceso, manipulación y población a la que va dirigida, tienen una alta probabilidad de causar daño a la salud.
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Antes de comenzar el muestreo en cada lugar de venta se solicitó registro sanitario dado que este garantiza que se venden productos actos para el consumo humano cumpliendo con estándares de calidad. Registro sanitario
Porcentaje
Con registro sanitario
97.5%
Sin registro sanitario
2.5%
7.3 Resultados de análisis microbiológicos Se llevó a cabo un análisis descriptivo de todas la muestras, mediante el Recuento de Coliformes totales, Recuento de E. coli, Recuento de S. aureus y la determinación de patógenos Salmonella sp., Shigella sp. y Listeria monocytogenes verificando si cumplían o no con los parámetros sugeridos por Reglamento Técnico Centroamericano. Se obtuvieron los siguientes resultados:
Tabla 1. Resultados de Recuento de indicadores de contaminación Puntos de Muestreo
Procedencia/origen
Punto 1 Punto 2 Punto 3 Punto 4 Punto 5 Punto 6 Punto 7 Punto 8 Punto 9 Punto 10 Punto 11 Punto 12 Punto 13 Punto 14 Punto 15 Punto 16
Olancho Olancho Olancho Danli Tocoa, Colon Olancho Varios Comayagüela M.D.C Olancho Olancho Tegucigalpa M.D.C Desconocido Olancho Olancho Tegucigalpa M.D.C Danli
Coliformes Totales (UFC/g) 6,000,000 900,000 6,600,000 7,300 2,140,000 72,500 1,890,000 230 209,500 1,970,000 16,100,000 71,500 22,000 31,500 1,850,000 850,000
Escherichia coli (UFC/g) 8,000 13,000 <10 800 30,000 1,000 12,000 10 1,900 22,500 1,000,000 1,150 6,000 3,000 100,000 29,000
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Staphylococcus aureus (UFC/g) 500 <10 <10 <10 150,000 <10 63,333 <10 <10 200,000 1,267 133 700 <10 20,000 6,667
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1,330,000 Punto 17 Tegucigalpa M.D.C Punto 18 Olancho 360,000 Punto 19 Olancho 119,500 Punto 20 Olancho 60,000,000 Punto 21 Tegucigalpa M.D.C 920,000 Punto 22 Desconocido 64,000 Punto 23 Olancho 550,000 Punto 24 Olancho 5,100,000 Punto 25 Tegucigalpa M.D.C 17,400,000 Punto 26 Danli 89,500 Punto 27 Tegucigalpa M.D.C 99,000,000 Punto 28 Olancho 2,200,000 Punto 29 Olancho 101,000,000 Punto 30 Olancho 1,960,000 Punto 31 Tegucigalpa M.D.C 920,000 Punto 32 Desconocido 64,000 Punto 33 Olancho 550,000 Punto 34 Olancho 5,100,000 Punto 35 Tegucigalpa M.D.C 17,400,000 Punto 36 Danli 89,500 Punto 37 Tegucigalpa M.D.C 99,000,000 Punto 38 Olancho 2,200,000 Punto 39 Olancho 101,000,000 Punto 40 Olancho 1,960,000 Valores permitidos por el Reglamento Centro Americano Coliformes Totales: No establecido Escherichia coli: 1000 UFC/g Staphylococcus aureus: 10 UFC/g
700,000 8,000 19,500 12,000,000 120 <10 24,500 5,100,000 1,600,000 50,000 500,000 2,000,000 8,000,000 80,000 120 <10 24,500 5,100,000 1,600,000 50,000 500,000 2,000,000 8,000,000 80,000
40,000 633 33 2,733 <10 133,333 126,667 <10 1,000 33 <10 3,667 12,666 2,000 <10 133,333 126,667 <10 1,000 33 <10 3,667 12,666 2,000
Tabla 2. Resultado de Determinación de microorganismos patógenos Puntos de Muestreo Punto 1 Punto 2 Punto 3 Punto 4 Punto 5 Punto 6 Punto 7 Punto 8 Punto 9
Procedencia/origen Olancho Olancho Olancho Danli Tocoa, Colon Olancho Varios Comayagüela M.D.C Olancho
Salmonella sp. (Presencia/ausencia en 25g)
Shigella sp. (Presencia/ausencia en 25g)
Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g
Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g
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Listeria monocytogenes (Presencia/ausencia en 25g) Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g
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Ausencia/25g Punto 10 Olancho Ausencia/25g Punto 11 Tegucigalpa M.D.C Ausencia/25g Punto 12 Desconocido Ausencia/25g Punto 13 Olancho Ausencia/25g Punto 14 Olancho Ausencia/25g Punto 15 Tegucigalpa M.D.C Ausencia/25g Punto 16 Danli Tegucigalpa M.D.C Ausencia/25g Punto 17 Ausencia/25g Punto 18 Olancho Ausencia/25g Punto 19 Olancho Ausencia/25g Punto 20 Olancho Ausencia/25g Punto 21 Tegucigalpa M.D.C Ausencia/25g Punto 22 Desconocido Ausencia/25g Punto 23 Olancho Olancho Ausencia/25g Punto 24 Ausencia/25g Punto 25 Tegucigalpa M.D.C Ausencia/25g Punto 26 Danli Ausencia/25g Punto 27 Tegucigalpa M.D.C Ausencia/25g Punto 28 Olancho Ausencia/25g Punto 29 Olancho Ausencia/25g Punto 30 Olancho Tegucigalpa M.D.C 920,000 Punto 31 64,000 Punto 32 Desconocido 550,000 Punto 33 Olancho 5,100,000 Punto 34 Olancho 17,400,000 Punto 35 Tegucigalpa M.D.C 89,500 Punto 36 Danli 99,000,000 Punto 37 Tegucigalpa M.D.C 2,200,000 Punto 38 Olancho 101,000,000 Punto 39 Olancho 1,960,000 Punto 40 Olancho Valores permitidos por el Reglamento Centro Americano Salmonella sp. : Ausencia Shigella sp. : No establecido Listeria monocytogenes: Ausencia
Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g 120 <10 24,500 5,100,000 1,600,000 50,000 500,000 2,000,000 8,000,000 80,000
Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g Ausencia/25g <10 133,333 126,667 <10 1,000 33 <10 3,667 12,666 2,000
En el Gráfico 4 de resultado de recuento de Coliformes totales se observa que solamente una muestra se encuentra dentro del límite máximo permitido con 230 UFC/g representado el 3% del total de las muestras Grafico 5.
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Grafico 4. Resultado de recuento de Coliformes totales
Coliformes Totales 9.000 8.000 7.000 6.000 5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 0.000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Grafico 5. Porcentaje de resultados de recuento de Coliformes totales
En el Grafico 6. de resultado de Escherichia coli se observa que del total de las 40 muestras solamente dos se encuentra dentro del límite máximo permitido con un resultado <10 UFC/g representado el 5% del total de las muestras Grafico 7.
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Grafico 6. Resultado de recuento de Escherichia coli
Escherichia coli 8.000 7.000 6.000 5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 0.000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Grafico 7. Porcentaje de resultados de recuento de Escherichia coli
En el Grafico 8. de resultados de recuento de Staphylococcus aureus que del total de las cuarenta muestras, veintiún de ellas cumplen un el límite máximo permitido representando un 53% del total de las muestras analizadas Grafico 9.
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Grafico 8. Resultados de recuento de Staphylococcus aureus
Staphylococus aureus 6.000 5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 0.000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Grafico 9. Porcentaje de resultado de recuento Staphylococcus aureus
7.4 Discusión
En este estudio no se investigó la forma de elaboración de los quesos artesanales solamente se evaluó su forma almacenamiento y distribución ya como un producto final y listo para su comercialización, evaluando así las condiciones en relación a infraestructura, higiene de las Investigación CESCCO 2015 | Practica Profesional Supervisada
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instalaciones, higiene de los productos e higiene de los manipuladores (Anexo 1.) La recepción de los quesos artesanales en todos los locales muestreados se da solamente cubiertos por una bolsa plástica. El producto se conservaba en vitrinas o cubiertos en bolsas plásticas o mosquiteros, en pocos casos en refrigeración como debería de ser. Representando así un 82.5% de los locales comerciales no cumplen con una correcta conservación de los productos lácteos, también se observó que se guardan cantidades de producto manteniéndolo en almacenamiento temperatura ambiente contribuyendo así al desarrollo y proliferación de los microorganismos en el producto previo a su venta. En relación al personal en su mayoría no presenten ningún tipo de protección ni el uso de gabachas, redecillas, guantes, los vendedores andan el pelo suelto y uso de joyería lo cual puede representar un foco de contaminación así representando un 70% de los lugares evaluados no cumple con un personal que cumpla con las condiciones higiénicas básicas exceptuando un 30% que si cuenta con un personal que se le ha brindado las condiciones necesarias para evitar algún tipo de contaminación. Una caracteriztica muy importante es la manipulacion al momento de vender el queso la cual de acuerdo a lo que observamos el 77.5% no cumple con una adecuada manipulacion, por no tener una medida de proteccion entre el producto y el vendedor, se da la manipulacion solamente usando una bolsa plastica, por la utilizacion del mismo cuchillo para diferentes productos lo cual puede ocasionar una contaminacion cruzada y colocacion del queso en superficies sucias e inadecuadas como se muestra en el Anexo 2. Las condiciones sanitarias de los locales en un 55% cumplen con una correcta limpieza y control de sus diferentes áreas de trabajo. La ubicación del producto es un factor importante debido que aunque se tomen las medidas higiénicas y una correcta conservación depende de su ubicación para evitar una contaminación debido a que
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un 37.5% de los locales los productos se encontraban mezclados con otros, también estaban expuestos al ambiente donde las moscas pueden contaminarlos. Cuadro 8.
Los resultados obtenidos en las muestras analizadas reflejan la falta de inocuidad de los quesos que se comercializan en los mercados del Municipio del Distritito central procedentes en su mayoría de Olancho y Comayagüela M.D.C Grafico 3. permiten evidenciar la contaminación microbiana entre los microorganismos indicadores de higiene deficiente en la manipulación, se pueden distinguir aquellos que indican contaminación de origen fecal, como son (Coliformes Totales y E. coli), y los que tienen otros orígenes, como S. aureus, procedente del tracto respiratorio, piel y mucosas.
Respecto al recuento de Coliformes totales en general el 97.5% de las muestras se encuentras con recuentos altamente elevados llegando hasta recuentos 101, 000,000 UFC/g Tabla 7. lo cual confirma la contaminación fecal en dichos productos. Lo que favorece en gran medida a que haya un riesgo potencial de la proliferación
de microorganismos
patógenos.
Se destacó la presencia de Escherichia coli en la mayoría los quesos artesanales representando un 97.5% Grafico.7 llegando a recuentos de hasta 12, 000,000 UFC/g Tabla 1. Encontrándose fuera de los límites máximos permitidos lo que corresponde acondiciones sanitarias y manipulaciones incorrectas lo que sugieren capacitar al personal manipulador sobre unas buenas prácticas de manufactura para así garantizar la inocuidad de los alimentos.
Los recuentos de Staphylococcus aureus resultado de este estudio, representa que un 47% Grafico 9. no cumple con los límites máximo permitido, que sería menos de la mitad de las
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muestras analizadas pero que representan un riesgo porque alcanzan recuentos de hasta 300,000 UFC/g Tabla 1. Señalando que para que se produzca una intoxicación por S. aureus es necesaria una dosis con 106 UFC/g por lo que es preciso llevar control en higiene, temperaturas, empaques, limpieza de equipos, utensilios y manipulación, con el fin de evitar el desarrollo del patógeno y la producción de su toxina.
En cuanto a las determinaciones de microorganismos patógenos tales como, Salmonella sp., Shigella sp. y Listeria monocytogenes los datos obtenidos demuestran la ausencia de estos patógenos en el 100% de las muestras. Tabla 2. aun así no se descarta la posibilidad de su presencia tomando en cuenta los resultados obtenidos señalan que hay contaminación de origen fecal, siendo esta una de las formas más comunes de contaminación por la mala manipulación del alimento.
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8. Conclusiones
Según las evaluaciones realizadas, en relación a infraestructura, higiene de las instalaciones, higiene de los productos e higiene de los manipuladores en su mayoría es inadecuado aumentando así el riesgo potencial de contaminación de los productos especialmente aquellos que no cuentan con las condiciones sanitarias básicas con las que deben cumplir.
Un 82.5% de los vendedores de productos lácteos almacenan sus productos a temperatura ambiente, un 70% no cumple con un personal que mantenga condiciones higiénicas adecuadas, la mala manipulación es un patrón en común en todos los vendedores dado que un 77.5% no cumple con una correcta manipulación además de esto se observó la presencia de moscas siendo algunos factores que
están
contribuyendo a aumentar aún más el grado de contaminación de los productos en los mercados.
La presencia de Coliformes totales y Escherichia coli en casi el 100% de las muestras indican un elevado número de microorganismos y poniendo en evidencia una obvia contaminación fecal dando a conocer la falta de calidad sanitaria de estos quesos artesanales, malas prácticas de higiene en su proceso haciendo la necesaria evaluación de toda la cadena del proceso de este producto.
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Se observó que a pesar de que el queso fresco artesanal es un alimento de alta demanda en el Municipio del Distrito Central refleja deficiencias higiénicas en cuanto su almacenamiento y distribución el cual representa un riesgo para la salud de los consumidores, por la deficiente calidad sanitaria y por consiguiente por la elevada carga bacteriana que presentaron las muestras estudiadas poniendo en evidencia la clara necesidad de implementar un sistema de capacitaciones en los principales centros de comercialización como lo son los mercados
El hecho de no haber aislado Salmonella sp. Shigella sp. y Listeria monocytogenes en ninguna de las muestras, esto no descarta que haya una futura contaminación debido a que el queso fresco es un producto altamente susceptible al desarrollo de estos microorganismo, en tanto que si se continua con la falta de condiciones sanitarias adecuadas se pone en riesgo que se dé la proliferación de patógenos ocasionando así un riesgo para la salud de los consumidores y el sistema de salud pública.
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9. Recomendaciones
A partir de la entrega de los resultados que será efectuado por el Departamento de Regulación Sanitaria y emitidos por Laboratorio de Microbiología Ambiental y de Alimento a cada sitio muestreo hacer una planificación para plantear las diferentes capacitaciones sobre la implementación de buenas prácticas sanitarias.
Se recomienda extender el análisis hacia los productores para determinar cuáles son los puntos críticos en la contaminación de los quesos frescos durante la producción de los mismos.
Con
esta investigación se deja
evidencia de
la presencia
de
elevada de
microorganismos indicadores de contaminación en quesos frescos, por lo que se debe seguir desarrollando estudios extendiendo en mayor número de locales comerciales si es posible en diferentes ciudades, aumentando así el numero de muestras que establezcan si hay presencia de patógenos en este tipo de alimentos.
Que los objetivos alcanzados por este estudio sirvan para incentivar al desarrollo de investigaciones en el sector lácteo artesanal y fortalecer así los mecanismos de control. poder plantear un sistema de capacitaciones de acuerdo a las debilidades que se encuentren en las investigaciones realizadas evitando de esta manera que sean un riesgo para la salud de la población consumidora.
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10. Referencias bibliográficas 1. FAO. Enfermedades transmitidas por alimentos y su impacto socioeconómico estudios de caso en Costa Rica, El Salvador, Guatemala, Honduras y Nicaragua. Cadmo Rosell; 2009 p. 139-154. 2. CESCCO. Investigación de la Contaminación Microbiológica de Productos Lácteos Producidos en forma artesanal. Tegucigalpa: N,p 27-29,2001. 3. Jiménez M, Villanueva G. Análisis de la Cadena de los Productos Lácteos en Honduras. IICA. 2001;:6, 9,11. 4. Menchu M, Méndez H. Análisis de la situación alimentaria en Honduras. INCAP. 2012;:20, 21, 22. 5. Pacheco Andino M. Situación actual de las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA) en Honduras [Licenciatura]. Zamorano; 2007. 6. http://www.bvsde.paho.org/cdgdwq/docs_microbiologicos/Indicadores%20PDF/bacteri as%20coliformes.pdf 7. http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/patogNOMStaphylococcusaureus_17365.p df 8. Mejía Núñez M, Murillo A, Suazo H, Campos J, Rodríguez E, Espinal O et al. Brote Por Staphylococcus aureus en una guardería en Choluteca, Honduras. Revista Médica Honduras. 2009; 77(2):57-98. 9. Morales Morales J. Evaluación microbiológica de seis productos lácteos y seis productos cárnicos elaborados en Zamorano [Licenciatura]. Zamorano; 2002. 10. Lagos L, Morales M, Castillo R. Escherichia coli O157:H7 patógeno emergente en Honduras. Revista Médica Honduras. 2002; 70:21-23.
11. Méndez I, Badillo C, Ortiz G. Caracterización microbiológica de Salmonella en alimentos de venta callejera en un sector universitario de Bogotá, Colombia. Julio a octubre de 2010. Revista de los estudiantes de medicina de la universidad industrial de Santander. 2011; 1(24):26-32. 12. Consejo de Ministros de Integración Económica Centroamericana. Reglamento técnico centroamericano criterios microbiológicos para la inocuidad de alimentos. 2009 p. 13.
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11. Anexos Anexo 1. Formatos para la evaluación de las condiciones sanitarias de los sitios de muestreo
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Anexo 2. Evaluación de las condiciones sanitarias en los locales comerciales
Muestreo
Conservación de los productos lácteos en locales comerciales
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Toma de muestras
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Anexo 3. Determinación de Salmonella sp.
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Anexo 4. Determinación de Shigella sp.
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Anexo 5. Determinación de Listeria monocytogenes
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Anexo 6. Recuento de Coliformes totales y Escherichia coli
Anexo 7. Recuento de Staphylococcus aureus
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