UNIDAD VI Liberación de medicamentos biotecnológicos
07-Mayo-2016 1
Minuta
• Tecnología • Micropartículas, nanopartículas. • Inyección depot, inyección jet, bombas.
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Liberación • La liberación de un fármaco es un método o proceso por el que se administra una formulación de una sustancia farmacológicamente activa, con el objetivo de asegurar que llegue a la localidad relevante “in vivo” para producir un efecto terapéutico con las mínimas reacciones adversas.
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Sistema de liberación • La
formulación o dispositivo que libera una sustancia terapéutica farmacológicamente activa en una determinada localidad del cuerpo se denomina sistema de liberación.
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Blanco farmacológico • La investigación se encuentra enfocada en: •
• • • •
Liberación de fármacos altamente tóxicos (radionucleotidos o toxinas) contra tumores.
Liberación de vectores de DNA contra correcciones genéticas en células específicas. Vascularización, no solo como tratamiento contra el cáncer; también para enfermedades pulmonares, cardiovasculares e inflamatorias. Células infectadas con patógenos. Que atraviesen la membrana encefálica.
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Blanco farmacológico • En el caso de los biotecnológicos los sistemas de liberación se encuentran enfocados en:
• •
Ruta de administración. Ej.: parenteral, nasal, pulmonar o transdérmica. Liberación del fármaco activo directamente en la estructura blanco, como puede ser un receptor específico o una población de células.
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Modificación química
• El corto tiempo de vida media de un péptido o una proteína se debe principalmente a la filtración renal y la eliminación por circulación sistémica de macromoléculas de 40-50 kDa o menores.
• Esto
se puede modificar con la conjugación de la cadena polipeptídica con alguna macromolécula polimérica con el objetivo de aumentar el peso molecular y/o el radio hidrodinámico del producto conjugado.
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Polietilenglicol • Incrementar el tamaño hidrodinámico y el peso molecular de un péptido o proteína
• Cambio otras propiedades fisicoquímicas las cuales incluyen: • • • •
Conformación de la proteína
Interacciones intermoleculares (debido al impedimento estérico) Distribución fisiológica (aumenta la hidrofobicidad) Propiedades de unión electrostática (altera la distribución de carga)
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• Algunos ejemplos de los cambios farmacológicos y farmacocinéticos que se producen al conjugar una proteína/ péptido con PEG son:
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PEG • El aumento en el tiempo de vida media, además de deberse a que se impide la depuración por filtración, puede deberse a que se impide la depuración por células retículo endoteliales, por la disminución en la formación de anticuerpos neutralizantes y a la protección contra las enzimas proteóliticas.
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PEG • Otros efectos positivos que se han reportados es el aumento de la estabilidad debido al enmascaramiento de los sitios hidrodinámicos se tiene como consecuencia la disminución de la formación de agregados, se evita la perdida de actividad y la inmunogenicidad.
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Polietilenglicol • El PEG es un compuesto sintetizado por un anillo aniónico que se abre para realizar una polimerización con el oxido de etileno, que se inicia por un ataque nucleofílico de un ion hidróxido al anillo del epóxido.
• Durante el proceso de adición del PEG, el PEG activado es conjugado covalentemente con la cadena polipeptídica.
• Debido a que los péptidos y proteínas son moléculas lábiles solo pueden utilizarse condiciones de reacción moderadas.
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Estrategias de adición de PEG • La estrategia general consiste en hacer reaccionar un grupo “X” de la proteína con un grupo “Y” complementario que se encuentra en la molécula de PEG, formando el conjugado PEG-proteína.
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Estrategias de adición de PEG • Adición en el N-terminal en un factor estimulador de colonias (filgrastim). Neulastim
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Estrategias de adición de PEG • Adición en un grupo tiol de un fragmento de anticuerpo con contra el factor de necrosis tumoral. Cimzia
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Estrategias de adición de PEG
• Direccionar la adición de PEG. • Mutagenesis sitio dirigida. Consiste
en el diseño de la proteína y la adición de una cisteína. La reacividad de este aminoácido es aprovechado para el ataque del grupo maleimida del PEG.
Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 25831-25864
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Estrategias de adición de PEG • Uso de enzimas. • Se realiza una mutagenesis dirigida a la proteína de interés con la adición de un grupo carboxiamida, de preferencia en algún loop para favorecer la reacción. La proteína con la glutamina se incuban con transglutaminasa y con PEG que cuenta con una amina primaria, formando un enlace covalente.
Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 25831-25864
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Desventajas • El incremento del tamaño molecular y la alteración de las propiedades fisicoquímicas puede resultar en la perdida de actividad farmacológica y/o la afinidad de unión al blanco farmacológico.
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Hiperglicosilación • Cuenta
con la ventaja de incrementar el tiempo de vida media, reducir la inmunogenicidad y mejorar la solubilidad. Además de que se pueden utilizar sustancias endógenas las cuales son biodegradables.
.
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Desventaja • El principal problema es que la modificación debe realizarse cuidadosamente:
•
• •
Se debe contar con la confirmación de la accesibilidad del retículo endoplásmico para la glicosilación
No debe colocarse en un área de unión al receptor o al sustrato ya que se perdería la actividad. Debe seleccionarse un epítope inmunodominante para tener un cambio favorable en la inmunogenicidad.
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Sistemas de liberación de nanopartículas Liposomas Niosomas Vehículos surfactantes 21
LIPOSOMAS
• Los liposomas son esféricos, consisten en partículas coloides, que a su vez están formados por una o más películas biomoleculares concéntricas de lípidos anfifílicos en formas de vesículas con una fase acuosa en el centro o entre las capas.
• El tamaño de los liposomas se encuentra entre los 10 nm a algunos micrómetros con una capa lipídica de alrededor de 6 nm.
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Clasificación liposomas • Los liposomas pueden ser clasificados dependiendo de su tamaño y por el número de capas lipídicas que tengan en:
•
• •
Vesículas grandes multilaminares (MLVs) que consisten en un gran número de bicapas lipídicas concéntricas y con un tamaño entre los 500 nm y algunos micrómetros.
Vesículas grandes oligolaminares (OLVs) con solo algunas bicapas lipídicas de un tamaño de 200 a 800 nm. Vesículas multivesiculares (MVVs) con un número pequeño de vesículas encapsuladas en una grande o en una de tamaño similar a las OLV.
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Clasificación liposomas •
•
Vesículas unilaminares grandes (LUVs) solo están formados por una capa bilipídica y tienen un tamaño mayor a 50 nm. Vesículas pequeñas unilaminares (SUVs) con solo una bicapa lipídica y un tamaño menor a 50 nm.
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Liposomas
J Mater Chem B Mater Biol Med. 2013 Dec 28; 1(48): 10
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Liposomas • Los liposomas son manufacturados de membrana de lípidos naturales, simisintéticos o sintéticos.
• El
más utilizado es un fosfolípido, la fosfatidilcolina que puede ser extraído de la soya o del yema del huevo.
• Otro
fosfolípido utilizado (siempre en combinación con fosfatidilcolina) son: fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina y fosfatidilglicerol.
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Liposomas • Los liposomas son manufacturados de membrana de lípidos naturales, simisintéticos o sintéticos.
• EL más utilizado es un fosfolípido fosfatidilcolina que puede ser extraído de la soya o del yema del huevo.
• Otro
fosfolípido utilizado (siempre en combinación con fosfatidilcolina) son: fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina y fosfatidilglicerol.
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Liposomas • El
colesterol siempre se agregado a la formulación en cantidades mayores a 50 mol para disminuir la fluidez de la bicapa de la membrana e incrementar la estabilidad del liposoma.
• Lípidos
sintéticos catiónicos como el 1,2-dioleoyloxy-3trimetil-aminopropano (DOTAP) o el N,N-dimetildiaminoetilN-carbamolcolesterol (DC-Chol) son siempre utilizados en la transfección de ácidos nucleicos en terapia génica.
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Elaboración • Método de película. Depositar los fosfolípidos en una delgada capa dentro de un frasco de vidrio utilizando un solvente orgánico, seguido de una subsecuente hidratación de los lípidos con agua. Produce la formación espontánea de MLVs y OLVs por la hidratación.
• Para
homogenizar la elaboración de la suspensión del liposoma y reducir el tamaño de las vesículas se pueden aplicar una homogenización por ultrasonido u homogenizar por alta presión.
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Elaboración
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Elaboración
• Método de inyección. Se coloca una solución de fosfolípidos en solvente orgánico, preferentemente etanol o éter. Esta solución es inyectado en un exceso de volumen de solución acuosa.
• Esto conduce a la formación de una monocapa lipídica en la interfase entre la solución acuosa y el solvente orgánico el cual genera SUVs y LUVs por evaporación del solvente orgánico.
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Elaboración • Evaporación por fase reversa. Los fosfolípidos son disueltos en un solvente orgánico que no es miscible en agua. El agua es agregada a la mezcla con sonicación para formar una emulsión. Al igual que en el método de inyección una monocapa lipídica es construida en la interfase generando LUVs
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Elaboración
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Elaboración • Los
liposomas pueden ser utilizados para fármacos hidrofílicos, lipofílicos y anfifílicos.
• Las
sustancias hidrofílicas son encapsuladas en el centro acuoso, las moléculas lipofílicas son incrustados en la bicapa lipídica.
• Por su naturaleza hidrofílica los péptidos y las proteínas son usualmente encapsulados en el centro del liposomas, también es posible realizar una conjugación química con grupos de la superficie.
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Encapsulación • Existen
dos técnicas diferentes para la encapsulación de péptidos y proteínas en los liposomas
•
•
Adición pasiva por incubación del fármaco con el liposomas a temperaturas iguales o relativamente más bajas que la temperatura de transición de los lípidos.
Adición activa por mezcla de la formulación del liposoma con la proteína en un buffer etanólico a elevadas temperaturas y bajo condiciones gentiles de agitación en remolino por un determinado tiempo.
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• Para
Conjugación
unir los péptidos y proteínas a la superficie de los liposomas, se utilizan reacciones de conjugación.
• Las más utilizadas antiguamente eran las reacciones entre los grupos aminos y los grupos carboxilos para formar enlaces amidas, la reacción entre las piridilditiol y los tioles para formar enlaces disulfuro, y la reacción entre los derivados de la maleimida y los tioles para formar enlaces éter.
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Conjugación • El
mayor beneficio de este tipo de modificación en el liposoma es la posibilidad de “funcionalizar” ciertas partículas del liposoma para que se tenga como blanco una población de células específica.
• Este
concepto ha sido utilizado para la manufactura de liposomas-inmunológicos que contienen anticuerpos conjugados o fragmentos de los anticuerpos en la superficie del liposoma.
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• Así mismo se ha utilizado esta técnica para generar liposomas que se encuentren conjugados con PEG o alguna otra sustancia que ayude a prevenir el reconocimiento de opsoninas evitando su rápida depuración.
• Realizando un cambio en el tamaño, carga de la superficie y la fluidez de la membrana de los liposomas es posible controlar la liberación del fármaco, la bioestabilidad “in vivo” y la biodistribución.
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•
http://www.liposomes.org/2011/09/immunoliposomes-different-strategies.html
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Niosomas • Son
vesículas similares a los liposomas que pueden ser formados por algunos dialquil polioxietileno o surfactantes no iónicos así como con una mezcla de colesterol y surfactante no iónico de una sola cadena alcalina con una “cabeza” de glicerol.
• Muestran beneficios farmacocinéticos aumentando el tiempo en la circulación, alterando la biodistribución y mejorando la estabilidad en comparación con los fármacos no encapsulados.
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Niosomas • Sus propiedades dependen de la composición de la bicapa lipídica y del método de producción. La mayor ventaja de los niosomas sobre los liposomas es que los ingredientes son químicamente más estables y no sufren degradación oxidativa como ocurre con algunos de los fosfolípidos.
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Nanopartículas sólidas lipídicas (SLN) • Son transportadores de fármacos lipofílicos coloidales con un centro sólido hidrofóbico con un tamaño entre 50-500 nm. Se preparan con lípidos no tóxicos naturales o sintéticos con una alta temperatura de fusión.
• Glicéridos como son los triglicéridos trimiristin, tripalmitin o tristearin son comúnmente utilizados como excipientes de la preparación de SLNs.
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Nanopartículas sólidas lipídicas (SLN) • Se
adicionan estabilizadores como fosfatilicolina para obtener un tamaño de partícula homogéneo.
• Métodos
producción: incluyen preparación con microemulsiones, homogenización por alta presión, tecnología del fluido súper crítico y técnicas de emulsión con solventes.
• Así como en los liposomas los biotecnológicos pueden ser incorporados a los SLN ya sea por adición o por inserción.
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Nanopartículas • Con el objetivo de mejorar la eficiencia en la adición se han realizado nuevos tipos de nanopartículas.
• Los transportadores lipídicos nanoestructurados (NLCs) son nanopartículas sólidas en las que la matriz lípidica sólida es intercambiado por aceite líquido que provee una alta solubilidad a los fármacos hidrofílicos en el material sólido lipídico.
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Nanopartículas poliméricas • Son transportadores de fármacos colidales sólidos elaborados por polímeros naturales, semi sintetícos o sintéticos con un diámetro del rango de nanómetros.
• Los
polímeros utilizados para la formación de las nanopartículas y la encapsulación de los fármacos puede o no ser biodegradable.
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Nanopartículas poliméricas • Se pueden clasificar en: • •
Nanoesferas sólidas consistentes en una estructura típica de la matriz en la que los fármacos son suspendidos o disueltos en la matriz o adsorbidos en la superficie. Nanocápsulas que son sistemas de vesículas con un centro líquido que contiene el fármaco y es elaborado por la membrana polimérica.
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Liberación • Factores que pueden afectar la liberación •
Tamaño y distribución de las partículas
• • • •
La adición del fármaco Propiedades fisicoquímicas del polímero Método de preparación Presencia y tipo de modificaciones en la superficie
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Liberación • Perspectivas
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Sistemas de liberación de proteínas del tamaño del orden de micras 50
Microesferas poliméricas biodegradables • Ayuda a proteger a las moléculas de los fármacos sensibles de la degradación y de forma simultanea prolongar o modificar la liberación.
• La
aplicación de microesferas evita la repetida inyección parenteral necesaria para mantener constante la concentración efectiva del fármaco.
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Microesferas poliméricas biodegradables • Polímeros
naturales utilizados son: colágeno, gelatina, albumina almidones o dextranos, así como polímeros sintéticos como los poliésteres, poliortoesteres, polianhidridos, polifosacenos y ácido pseudopoliamino.
• El polímero apropiado puede ser degradado “in vivo” por un mecanismo enzimático o no enzimático para producir bioproductos no tóxicos lo cual liberara de forma progresiva el fármaco encapsulado.
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Microesferas poliméricas biodegradables • Microcápsulas son partículas que consisten en un centro líquido o sólido donde el fármaco es rodeado por un caparazón sólido del polímero biodegradable.
• Micropartículas con estructura compleja son ejemplos de partículas llenas de gas con el fármaco embebido en el caparazón de las partículas que consisten solo en los agregados de pequeños micro o incluso nanopartículas.
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Manufactura •
•
•
La técnica más utilizada es la separación de fase (co-acercación), doble emulsión y secado por spray.
La co-acercación fue el primer método utilizado para encapsular un péptido (Nafarelin) a escala industrial. Consiste en que las partículas de proteína sólida son dispersadas en una fase orgánica que contiene el polímero biodegradable hidrofóbico, que con aceite de silicón es agregado con el objetivo de reducir la solubilidad del polímero en el solvente. Como resultado el polímero enriquecido en la fase líquida encapsula las partículas dispersas de la proteína, lo cual es seguido por un exhaustivo paso de lavado con heptanos. La toxina de la difteria o la hormona luteinizante
han sido encapsulado exitosamente por este técnica.
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Manufactura • La
técnica de doble emulsión es fácil ya que es como la formación de una emulsión agua en aceite, en agua.
• Inicialmente
la solución acuosa del péptido o proteína es emulsificada en una solución orgánica del polímero hidrofóbico para formar una emulsión agua/aceite. Posteriormente se requiere el uso de un surfactante como los esteres y una intensa homogenización utilizando fuerte agitación o por sonicación.
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Manufactura
• Posteriormente la emulsión es dispersada en un exceso de fase acuosa que contiene un estabilizador polimérico con un surfactante activo como el polivinil alcohol.
• Para
la obtención de las partículas el solvente orgánico residual es removido por evaporación utilizando elevadas temperaturas o vacío.
• El estrés generado durante la homogenización emulsificación puede provocar desnaturalización de la proteína.
• Esta
la
técnica ha sido ampliamente somatropina, rhEPO y gonadotropina
o durante la adsorción y/o
utilizada
parra
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Manufactura • El secado por spray es una técnica de manufactura donde la formulación líquida es atomizada bajo una corriente de aire caliente, el cual es rápidamente evaporada formando partículas solidas usualmente en el rango de micrometros.
• La principal ventaja radica en que la proteína ya se encuentra en forma seca.
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Implantes poliméricos • Los implantes poliméricos son pequeñas varillas cilíndricas con un diámetro de 1-2 mm y una longitud de alrededor de 11.5 cm.
• Para su administración es necesaria el uso de agujas largas o de una incision quirúrgica.
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Ejemplos
• Con este nuevo tipo de formulación se ha logrado tener fármacos cuya liberación sea constante hasta por 3 meses.
Zoladex Acetato de goserelina
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Dispositivos de inyección • Existe
una gran cantidad de dispositivos de inyección disponibles en el mercado, los más interesantes son aquellos que son utilizadas directamente por el paciente y que permiten el ajuste de dosis. Dentro de los más comunes están las jeringas prellenadas, autoinyectores, inyectores de jeringa y los dispositivos en forma de pluma con agujas muy delgadas
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Inyectores jet • Otra técnica de inyección para formulaciones líquidas de péptidos o proteínas son inyecciones libres de agujas que cuentan con inyectores jet de alta velocidad.
• Los inyectores líquidos jet utilizan la energía cinética de la inyección de alta velocidad, que cuenta con un diámetro en el rango de 76-360 μm, el diámetro del inyector de huella es menor que el diámetro de una aguja hipodérmica estándar (810 μm por 21 G)
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Inyectores • Los inyectores jet penetran la piel y liberan el péptido o la proteína de forma intradérmica, intramuscular o subcutánea. Sin embargo la manufactura de estos sistemas es complicada.
• Las
proteínas pueden ser dañadas durante el proceso de llenado, por ejemplo por los sistemas de bombeo y/o durante el almacenamiento por el uso de nuevos materiales como son los silicones. Además el estrés generado durante la aceleración de la inyección jet de la formulación líquida de la proteína puede causar problemas de inestabilidad a la proteína.
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Inyección continua • Se cuenta con inyecciones de pulso o de modo continuo con control de velocidad de inyección/infusión por parte del paciente, utilizando una sistema de bombeo portátil.
• El sistema consiste en un reservorio externo que contiene la formulación con la proteína y una pequeña aguja junto con un control por microcomputadora que controla la velocidad de liberación del fármaco.
• Uno
de los requerimientos es que la proteína/péptido sea estable a temperatura ambiente.
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Inyección por depósito • Una
alternativa a esto es la formulación parenteral de depósito cuya formulación provee de forma continua la liberación del fármaco en un largo periodo de tiempo a partir una solo administración.
• Un ejemplo incluye los geles inyectables el cual esta formado por PLGA o en SAIB (acetato isobutirato de sacarosa) disueltas en un solvente orgánico
• Los
sistemas acuosos consisten en copolímeros de lactide/glicolide o PEG el cual forma un gel viscoso .
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Inyección por depósito • Otro sistema de depósito incluye matrices manufacturadas de derivados del ácido hialurónico que se degrada enzimáticamente y ha demostrado poder aplicarse en la administración intraocular e intraarticular.
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Inyección por depósito • Las formulaciones depósito de proteínas en sólido incluye nanopartículas, micropartículas e implantes.
• Las micropartículas e implantes son usualmente inyectadas o implantados vía s.c. en el tejido para proveer la liberación del fármaco a una concentración constante ya sea en un área local o en el sistema circulatorio.
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Inyección por depósito • Las nanopartículas y liposomas son generalmente inyectadas de forma intravenosa. El principal propósito de estos dispositivos es que los fármacos vayan directamente hacia el blanco
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Sistemas de liberación • •
•
La preparación sólida en forma de nano y micropartículas ha ganado un gran interés en años recientes debido a permitir el paso de macromoléculas a través de la mucosa nasal y la protección de la degradación enzimática. Partículas basadas en almidones degradables, dextranos, quitosano, celulosa microcristalizada, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa, carbomero y polímeros de gelatina han sido utilizados (preferentemente).
Actualmente existe en el mercado la FluMist ® una vacuna contra la influenza tipo A y B que es utilizada para la inmunización de individuos de entre 2 y 49 años de edad.
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Perspectivas • La principal estrategia para la administración por vía oral es el encapsular los péptidos o proteínas en nanopartículas que pueda proveer la suficiente protección contra la degradación y permita la penetración del fármaco y su paso a través de la mucosa intestinal.
• Los
sistemas acarreadores a nano escala se encuentra sustentado en el uso de liposomas, microemulasiones, lípidos y nanopartículas poliméricas
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